Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2819
Title: Analysis of Tap73-dependet signaling via integrated Omics technologies
Other Titles: Analisi della segnalazione cellulare dipendente da TAp73 attraverso tecnologie omiche
Authors: Marrocco, Cristina
Keywords: Metabolomics;Proteomics;TAp73;Signaling;Metabolomica;Proteomica;Segnalazione cellulare;BIO/11
Issue Date: 19-Jun-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo
Abstract: 
In 1997, p73 emerged as a structural and functional homolog of the tumor suppressor p53 [1]. p73 and p53 genes consist of an N-terminal transactivation domain, a central sequence-specific DNA-binding domain, and a C-terminal oligomerization domain respectively [2, 3]. The human p73 genes are composed of 15 exons spanning over 80 000 bp on chromosome 1p36.3 [2]. Contrary to p53, p73 gene is very complex, since it expresses at least seven alternatively spliced C-terminal isoforms (α, β, γ, δ, ε, ζ and η – also referred to as transactivation proficient or TA variants) and at least four alternatively spliced N-terminal isoforms initiated at different ATG (including ΔNp73α and ΔNp73β, lacking the transactivation domain) [2-5]. Alternatively spliced TA isoforms display different transcriptional and biological properties. Based on their sequence similarity at the DNA binding domain, it is not surprising that p53 and TAp73 isoforms can share some transcriptional targets and, as a consequence, elicit similar biological effects. Ectopic expression of TAp73 isoform is indeed able to transactivate p53-responsive genes causing cell cycle arrest and apoptosis [2]. TAp73-triggered apoptosis follows several pathways [6-8], including mitochondrial intrinsic pathway (through activation of PUMA [9], Noxa [10] and Bax [6]) and via endoplasmic reticulum (ER) stress through the induction of Scotin [11]. Pro-apopotic activity of TAp73 variants can be modulated [12,13] by phosphorylation of TAp73 via checkpoint kinase Chk1 and Chk2 [14] or AMPK [15], or through collaborative binding to c-Abl [16,17].
In contrast to the TAp73 isoforms, the ΔN variants ΔNp73α and ΔNp73β, which are generated by alternative promoter utilization, exhibit dominant-negative behavior toward wild-type p73 as well as p53, display anti-apoptotic and oncogenic activity and it is involved in the regulation of the DNA damage checkpoint response [18-22]. Thus, the pro-apoptotic activity of p73 is determined by the relative expression levels of its TAp73 and dominant-negative ΔNp73 variants in cells [23]. However, exceptions to this assumption are all but infrequent, especially in the light of recent reports indicating a controversial role of the TAp73α isoform in mitigating apoptotic events in K-562 leukemia cells [24], small cell lung carcinoma [25,26], and human ovarian carcinoma cell line A2780 [27]. Therefore, although TAp73 isoforms are able to bind specifically to DNA through p53 responsive elements, transcriptional targets of p73 isoforms and p53 can not be entirely comparable, and thus their biological functions. Accordingly, the analysis of the isoform specific p73 knock-out mice revelead a peculiar function of p73 during neurodevelopment, mitotic spindle checkpoint and DNA damage checkpoint response, suggesting that p73 biological functions are not entirely redundant with those of p53.
Besides activating the transcription of genes-encoding proteins, p73 is also able to upregulate the expression of miRNAs, such as let-7, miR-34, miR-15/16a, miR-145, miR-29, miR-26, miR-30,
miR-146a [28] and miR-200 family [29]. While connections between miRNAs and cancer cell metabolism are increasingly being confirmed [30,31], the actual effect of TAp73 expression in cancer cell metabolism still remain under-investigated. Indeed, energy metabolism is a key hallmark of cancer [32, 33], and tumor suppressor genes such as p53 play a central role in the modulation of glucose metabolism [34]. So far, available results suggest a role for TAp73α in the dysregulation of mitochondrial energy metabolism and exacerbation of mitochondria-induced ROS production in HCT116 and TAp73 knock out MEF cells [35]. The underlying mechanisms could involve the complex IV subunit cytochrome C oxidase subunit 4 (Cox4i1), a direct target of TAp73α [35].
The aim of this study is to seek a further understanding of the TAp73α-mediated cellular signaling. For this, we performed an integrated omics approach, based upon the simultaneous application of metabolomics, lipidomics, proteomics and phosphoproteomics. The application of multiple omics analyses to the same biological matrix holds several advantages, in that it helps coping with the intrinsic limitations of each independent approach [36], while providing further clues to the understanding of the biological phenomenon under investigation, even when scarce direct overlap among results from different omics is observed [37]. In this view, integration of omics disciplines represents the inevitable evolution of unsupervised approaches, towards the achievement of actual Systems Biology-wide comprehension of living systems [38].

Il p73 fu scoperto nel 1977 come omologo funzionale e strutturale del p53.[1] Insieme al p63, il p73 e p53 costituiscono la famiglia dei geni del p53 poiché la loro struttura è caratterizzata dalla da un dominio N-terminale di transattivazione (TA), un dominio centrale di legame al DNA, che lega una sequenza specifica, e un dominio C-terminale di oligomerizzazione [2,3]. Il gene umano p73 è localizzato sul cromosoma 1p36.3 ed è composto 80000 bp suddivisi in 15 esoni [2]. Contrariamente al p53, il p73 è un gene molto complesso e porta alla produzione di 7 isoforme per splicing alternativo al C-terminale (α, β, γ, δ, ε, ζ and η – chiamate anche transattivatrici o varianti TA) e 4 isoforme prodotte per splicing alternativo al N-terminale trascritte da partire da diversi ATG [2-5]. Le varie isoforme TA hanno diverse proprietà biologiche e trascrizionali. Il p53 e TAp73, avendo una omologia nel dominio centrale per il legame al DNA, condividono alcuni geni bersaglio e mostrano effetti biologici simili. Infatti, alcuni studi mostrano che l’espressione ectopica del TAp73 è in grado di attivare geni bersaglio del p53 e indurre arresto del ciclo cellulare e apoptosi [2].
È noto che il TAp73 guida l’apoptosi attraverso diversi pathway [6-8] come il pathway intrinseco mediato da mitocondri (attraverso l’attivazione di PUMA [9], Noxa [10] e Bax [6]) e lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) attraverso l’induzione di Scotin [11]. L’attività pro-apoptotica delle isoforme TAp73 può essere modulata [12,13] con la fosforilazione del TAp73 attraverso le chinasi ChK1 e Chk2 [14], AMPK [15] o con il legame a c-Abl [16,17].
Al contrario, le isoforme ΔNp73α e ΔNp73β, che mancano del dominio di transattivazione (TA) poiché prodotte dall’utilizzo di un diverso promotore rispetto alle isoforme TA, esibiscono un comportamento di dominante negativo nei confronti del p73 e p53 mostrando una attività anti apopotica e oncogenica e sono coinvolte nella regolazione della risposta del checkpoint da danno al DNA [18-22]. Molti studi evidenziano che in realtà l’attività pro-apoptotica del p73 è determinata dal livello di espressione nelle cellule delle diverse isoforme del TAp73 e del ΔNp73 [23]. Altri studi mostrano un ruolo controverso della isoforma TAp73α nel dirigere gli eventi di apoptosi nelle cellule leucemiche K-562 [24], nel carcinoma polmonare a piccole cellule [25,26] e nella linea cellulare di carcinoma ovarico umano A2780 [27].
I studi effettuati su topi knock-uot mostrano una funzione caratteristica del p73 durante il neurosviluppo, nella formazione del fuso mitotico e durante la risposta del danno al DNA, indicando che la funzione biologica del p73 non è completamente ridondate con quella del p53. Inoltre, il p73 è in grado di up regolare l’espressione di miRNA, quali let-7, miR-34, miR-15/16a, miR-145, miR-29, miR-26, miR-30, miR-146a [28] e la famiglia miR-200 [29].
Mentre le connessioni tra miRNA e il metabolismo del cancro cellulare stanno avendo dei riscontri [30, 31], l’effetto dell’espressione del TAp73 sul metabolismo cellulare di cellule cancerose rimane ancora sotto investigazione. Infatti, il metabolismo energetico è una caratteristica chiave del cancro [32,33], e i geni soppressore di tumore come il p53 giocano un ruolo fondamentale nella modulazione del metabolismo del glucosio [34]. Alcuni studi suggeriscono un ruolo del TAp73 nella disregolazione del metabolismo energetico mitocondriale e una intensificazione della produzione dei ROS dai mitocondri nelle cellule HCT116 e TAp73 knock out MEF [35]. Il meccanismo sottolineato potrebbe coinvolgere il Cox4i1, un target diretto del TAp73α [35].
In questi studi abbiamo utilizzato diversi approcci omici. Per studiare al meglio la segnalazione cellulare mediata dall’espressione del TAp73α abbiamo applicato tecniche di proteomica, fosfoproteomica, metabolomica e lipidomica investigando su cellule Saos-2 indotte per l’espressione del TAp73α.
L’applicazione di diverse tecniche omiche allo stesso campione biologico ha come vantaggio di ottenere una panoramica dell’intero sistema in esame.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia molecolare
URI: http://hdl.handle.net/2067/2819
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