In planta evidences for the involvement of xylanase inhibitors in wheat defence against fungal pathogens

Abstract

Cereals contain xylanase inhibitor (XI) proteins which inhibit microbial xylanases and are considered part of the defense mechanisms to counteract microbial pathogens. Nevertheless, in planta evidence for this role has not been reported yet. Therefore, we produced a number of transgenic plants constitutively overexpressing TAXI-III, a member of the TAXI type XI that is induced by pathogen infection. Results showed that TAXIIII endows the transgenic wheat with new inhibition capacities. We also showed that TAXI-III is correctly secreted into the apoplast and possesses the expected inhibition parameters against microbial xylanases. The new inhibition properties of the transgenic plants correlate with a significant delay of Fusarium head blight (FHB) disease symptoms caused by Fusarium graminearum but do not significantly influence leaf spot symptoms caused by Bipolaris sorokiniana. We showed that this contrasting result can be due to the different capacity of TAXI-III to inhibit the xylanase activity of these two fungal pathogens. To elucidate the molecular mechanism underlying the capacity of the TAXI-III transgenic plants to limit FHB symptoms, we treated wheat tissues with the xylanase FGSG_03624 strongly expressed by F. graminearum during wheat spike infection, previously demonstrated to induce cell death and hydrogen peroxide accumulation (Sella et al., 2013). Experiments performed on glumes of flowering wheat spikes showed that the presence of TAXI-III significantly decreased cell death. Most interestingly, a reduced cell death was also obtained by treating with the same xylanase glumes of TAXI-III transgenic plants as compared to control non transgenic plants. Moreover, the inhibitor counteract the cell death activity of this xylanase also in wheat cell suspension cultures. Molecular modelling predicted an interaction between TAXI-III and the xylanase FGSG_03624. In particular, TAXI-III interacted with a residue within the peptide that is thought to be responsible for the necrotizing activity. These results suggest that the reduced FHB symptoms on transgenic TAXI-III plants can be due to the direct inhibition of xylanase activity secreted by the pathogen but also to the capacity of TAXI-III to prevent host cell death, possibly by preventing the recognition of the xylanase FGSG_03624 by a plant receptor involved in cell death elicitation, as previously suggested in tomato. In conclusion, these results provide, for the first time, direct evidence in planta that XI are part of the immune system for plant defense against fungal pathogens and suggest the possible molecular mechanism underlying the protective role of XIs.

I cereali contengono inibitori proteici delle xilanasi che inibiscono le xilanasi prodotte dai microrganismi e sono considerati parte dei meccanismi di difesa che la pianta usa per contrastare i microrganismi patogeni. Tuttavia, finora non sono state riportate evidenze dirette in planta che supportino tale ipotesi. In questo lavoro di tesi sono state prodotte linee transgeniche di frumento duro sovraesprimenti TAXI-III, un membro della famiglia degli inibitori delle xilanasi di tipo TAXI che viene indotto in seguito ad infezione. Le linee transgeniche hanno mostrato che TAXI-III conferisce alla pianta nuove capacità inibitorie, inoltre l’inibitore viene correttamente secreto nell’apoplasto e possiede i parametri inibitori attesi nei confronti delle xilanasi prodotte dai microrganismi. Le nuove proprietà inibitorie delle piante transgeniche correlano con una riduzione significativa dei sintomi di fusariosi causati da Fusarium graminearum, ma non influenzano significativamente i sintomi di necrosi fogliare causati da Bipolaris sorokiniana. Questi risultati contrastanti sembrano essere dovuti alla diversa capacità inibitoria di TAXI-III nei confronti delle attività xilanasiche prodotte da questi due funghi patogeni. Per chiarire il meccanismo molecolare che sta alla base della capacità delle piante transgeniche sovraesprimenti TAXI-III di limitare i sintomi di fusariosi, sono stati trattati i tessuti di frumento con la xilanasi FGSG_03624 di F. graminearum che ha la capacità di indurre la morte cellulare e l’accumulo di perossido di idrogeno (Sella et al., 2013). Gli esperimenti condotti sulle glume di spighe di frumento in fioritura hanno mostrato che la presenza di TAXI-III riduce significativamente la morte cellulare e, cosa ancora più interessante, una analoga riduzione è stata ottenuta anche trattando con la stessa xilanasi glume di piante transgeniche sovraesprimenti TAXI-III. Inoltre è stato dimostrato che l’inibitore TAXI-III riduce la morte cellulare, causata dalla xilanasi necrotizzante, anche in colture di cellule di frumento in sospensione. La modellizzazione molecolare ci ha permesso di predire una interazione tra TAXI-III e la xilanasi FGSG_03624. In particolare, TAXI-III interagisce con un residuo che compone il peptide ritenuto responsabile della attività necrotizzante. Questi risultati suggeriscono che la riduzione dei sintomi da fusariosi osservati sulle piante transgeniche sovraesprimenti TAXI-III sia dovuta all’inibizione diretta da parte di questo inibitore delle xilanasi secrete dal patogeno ma anche alla capacità di TAXI-III di prevenire la morte cellulare, probabilmente impedendo il riconoscimento della xilanasi da parte di un ipotetico recettore della pianta coinvolto nell’elicitazione della morte cellulare, come precedentemente proposto in pomodoro. In conclusione i risultati riportati in questa tesi dimostrano, per la prima volta, che gli inibitori delle xilanasi fanno parte del sistema immunitario di difesa della pianta contro i patogeni fungini e suggeriscono il possibile meccanismo molecolare sottostante il ruolo protettivo dell’inibitore TAXI-III.