Functional characterization of the parthenocarpic fruit mutation in tomato (Solanum lycopersicum L.)

Abstract

Parthenocarpy is the production of seedless fruits in the absence of pollination and/or fertilization. This process has been extensively studied in tomato (Solanum lycopersicum L.) because it offers a method to overcome unfavourable environmental conditions that reduce pollen production, anther dehiscence and, as a consequence, fruit set. Among the different sources of genetic parthenocarpy described in tomato, the parthenocarpic fruit (pat) mutation, object of the thesis, is of particular interest because of its strong expressivity, high fruit set and enhanced fruit quality. Previous studies have thoroughly characterized the pat mutation from the genetic, biochemical and qualitative standpoint. More recent research described the complexity of the pat syndrome, which associates a strong competence for parthenocarpy with a complex floral phenotype, involving stamen (reduced length and carpelloid features) and ovule (arrested integument growth and loss of viability) development. By a positional cloning approach, the Pat locus was mapped on the long arm of chromosome 3 and recently, by a candidate gene approach, nine candidates have been addressed as potentially responsible for the mutant phenotype. Among them, four genes, known to be involved in reproductive processes, were sequenced in the wild type (WT) and near-isogenic pat line. After sequencing, a single point mutation was found only in the tomato ortholog of ATHB15, also known as CORONA (CNA) or INCURVATA4 (ICU4), in Arabidopsis. ATHB15/CNA/ICU4 is a transcription factor (TF) belonging to the class III HDZip subfamily protein. Accordingly to this finding, in tomato, we named this gene Solanum lycopersicum HB15 (SlHB15). Starting from this background, the thesis aimed to confirm that SlHB15 is involved in biological processes that, if deregulated, could lead to parthenocarpy and to highlight differentially expressed genes in the WT and pat ovary during fruit set. Using different bioinformatic tools, the amino acid substitution found in the SlHB15 protein encoded by the pat allele was predicted to be not tolerated for the protein function. In addition, following an in silico comparative approach between ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis and SlHB15 in tomato, interesting highlights about its involvement in the regulation of auxin homeostasis in plant tissues and biological processes (e.g. flower development and fruit set) were found (Chapter 2). So far, RNA interference and complementation experiments performed for the genetic confirmation of the mutation were not definitive, but promising observations of putatively SlHB15-silenced plants reinforced the hypothesis that SlHB15 underlies the pat mutation. Furthermore, in order to find phenotypic similarities between pat and single mutants for its ortholog ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis, a characterization of the cna-1 (loss-ofii function) and icu4-1 (gain-of-function) mutants for this gene, was performed. Interestingly, pleiotropic effects showed by pat (e.g. deviation of the number of cotyledons and aberrant ovules) and parthenocarpy, were also observed in these mutants, indicating again that SlHB15 could represent the locus of the pat mutation (Chapter 3). A microarray experiment was performed in order to identify differentially expressed genes (DEGs) in the WT and pat ovary during fruit set. Based on their expression pattern, the DEGs were categorized into five groups of clusters representing different biological trends. One of the groups deserving more attention was named ‘Controlling complex’ and contained putative negative or positive regulators of fruit set (genes up- or down-regulated at pre-athesis in the WT ovary and deregulated in the pat mutant). Interesting genes belonging to this group encoded tomato orthologs of Arabidopsis TFs regulating the meristem differentiation and development of floral organs, such as SHOOTMERISTEMLESS (STM), BIG PETALp (BPEp), AINTEGUMENTA (ANT) and CRABS CLAW (CRC). These findings represented new insights, because so far these genes belonging respectively to the KNOX, bHLH, AP2/ERF and YABBY families of TFs had never been so directly associated to parthenocarpy. Finally, these TFs and other selected genes were studied also in other pathenocarpic systems (pat-2, pat-3/pat-4, EMSiaa9 and RNAi-ARF7) in order to increase the understanding of parthenocarpy in tomato and to find homologies between these different sources for such an agronomically important trait (Chapter 4). Finally, a genetic interaction study between pat and Curl (Cu), a mutation responsible for the overexpression of the gene LeT6/TKn2 (tomato ortholog of STM in Arabidopsis) in vegetative and floral organs, was performed. Overall, the phenotypic and molecular characterization of the pat Cu double mutant confirmed findings previously reported and indicated that KNOX family members, such as LeT6/TKn2, may act as negative regulators of the fruit set (Chapter 5). Taken together, results obtained from this thesis increased the understanding of the genetic and molecular bases of fruit set and parthenocarpy in tomato.

La partenocarpia può essere definita come la produzione di frutti senza seme in assenza di impollinazione e/o fecondazione. Questo processo è stato studiato in maniera estensiva in pomodoro (Solanum lycopersicum L.) poiché rappresenta un metodo per superare le avverse condizioni ambientali responsabili di una ridotta produzione di polline, deiscenza delle antere e di conseguenza dell’allegagione. Tra le diverse fonti di partenocarpia genetica descritte in pomodoro, la mutazione parthenocarpic fruit (pat), oggetto di studio della presente tesi, è di particolare interesse in quanto presenta una forte espressività del carattere ed è responsabile di un’elevata allegagione con la produzione di frutti qualitativamente migliori. Studi precedenti hanno caratterizzato la mutazione pat sia da un punto di vista genetico che biochimico. Mentre, ricerche più recenti descrivono la complessità della sindrome pat, che associa al carattere di partenocarpia un complesso fenotipo fiorale legato allo sviluppo degli stami (lunghezza ridotta e caratteristiche carpelloidi) e degli ovuli (perdita di vitalità dovuta ad un arresto della crescita del tegumento). Attraverso un approccio di clonaggio posizionale, il locus della mutazione pat è stato collocato sul braccio lungo del cromosoma 3 e di recente, attraverso un approccio per geni candidati, nove geni sono stati indicati come potenziali responsabili del fenotipo mutante. Quattro di essi, coinvolti in meccanismi riproduttivi, sono stati sequenziati sia nella linea wild type (WT) che nella quasi-isogenica pat. Dopo tale sequenziamento, una singola mutazione puntiforme è stata trovata nel gene ortologo di pomodoro ad ATHB15, conosciuto anche come CORONA (CNA) o INCURVATA4 (ICU4), in Arabidopsis. ATHB15/CNA/ICU4 codifica per un fattore di trascrizione (TF) che appartiene alla classe III della sottofamiglia di proteine HD-Zip. In pomodoro, il gene è stato chiamato Solanum lycopersicum HB15 (SlHB15). A partire da queste informazioni, la tesi ha avuto come scopo quello di: (i) confermare che SlHB15 è coinvolto in processi biologici che, se deregolati, inducono partenocarpia; (ii) mettere in evidenza geni differenzialmente espressi nell’ovario WT e pat durante il processo di allegagione. Utilizzando diverse risorse bioinformatiche, la sostituzione amminoacidica presente nella proteina SlHB15, codificata dall’allele pat, è stata predetta essere non tollerata per la sua funzione. Inoltre, attraverso un altro approccio in silico di tipo comparativo tra ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis e SlHB15 in pomodoro, sono stati trovati interessanti suggerimenti riguardo al coinvolgimento di tale gene nella regolazione dell’auxina in diversi tessuti e durante differenti processi biologici, come per esempio lo sviluppo fiorale ed l’allegagione (Capitolo 2). iv Per la conferma genetica della mutazione sono stati eseguiti degli esperimenti di RNA interference e complementazione. Finora, tali esperimenti non hanno portato a dei risultati definitivi, anche se l’osservazione promettente di piante putativamente silenziate avvalora l’ipotesi che SlHB15 possa rappresentare il gene candidato per la mutazione pat. Inoltre, per confermare ulteriormente tale ipotesi e cercare delle similarità a livello fenotipico tra pat e mutanti singoli per ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis, è stata eseguita una caratterizzazione dei mutanti cna-1 (loss-of-function) e icu4-1 (gain-of-function) per tale gene. È stato molto interessante notare che entrambi i mutanti singoli per ATHB15/CNA/ICU4 hanno mostrato dei fenotipi paralleli a quelli dalla mutazione pat in pomodoro, come ad esempio la deviazione del numero di cotiledoni, ovuli aberranti e partenocarpia (Capitolo 3). Con lo scopo poi di identificare geni differenzialmente espressi (DEGs), nell’ovario WT e pat, è stato condotto un esperimento microarray. In base al loro pattern di espressione, i DEGs sono stati categorizzati in cinque gruppi di clusters rappresentanti differenti andamenti biologici. Uno dei gruppi che ha destato notevole interesse, definito ‘Controlling complex’, conteneva dei putativi regolatori negativi o positivi dell’allegagione (geni sovra o sotto-regolati allo stadio di pre-antesi nell’ovario WT e deregolati in pat). In tale gruppo sono stati trovati geni codificanti in pomodoro per ortologhi a TFs di Arabidopsis coinvolti nella differenziazione del meristema e nello sviluppo degli organi fiorali, come ad esempio SHOOTMERISTEMLESS (STM), BIG PETALp (BPEp), AINTEGUMENTA (ANT) e CRABS CLAW (CRC). Questi risultati rappresentano una novità, poiché tali TFs non erano mai stati associati così direttamente a fenomeni di partenocarpia. L’espressione di questi ed altri geni, selezionati dall’analisi trascrittomica, è stata studiata anche in altri sistemi partenocarpici (pat-2, pat-3/pat-4, EMS-iaa9 e RNAi-ARF7) con lo scopo di aumentare la comprensione dell’allegagione e trovare omologie tra queste differenti fonti di partenocarpia in pomodoro (Capitolo 4). Infine, è stato condotto uno studio dell’interazione genetica tra pat e Curl (Cu), una mutazione dominante responsabile per la sovra-espressione del gene LeT6/TKn2 (ortologo in pomodoro del gene STM di Arabidopsis) in organi vegetativi e fiorali. Complessivamente, la caratterizzazione fenotipica e molecolare del doppio mutante pat Cu ha confermato dei risultati precedenti che indicavano LeT6/TKn2 come un importante regolatore negativo dell’allegagione (Capitolo 5). Presi assieme, i risultati ottenuti nella presente tesi hanno aumentato la conoscenza delle basi genetiche e molecolari dell’allegagione e della partenocarpia in pomodoro.