Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2816
Title: Functional characterization of the parthenocarpic fruit mutation in tomato (Solanum lycopersicum L.)
Other Titles: Caratterizzazione funzionale della mutazione parthenocarpic fruit in pomodoro (Solanum lycopersicum L.)
Authors: Ruiu, Fabrizio
Keywords: Solanum lycopersicum L.;Fruit set;Parthenocarpy;Parthenocarpic fruit;Transcriptomic analysis;Allegagione;Partenocarpia;Analisi del trascrittoma;AGR/07
Issue Date: 11-Jun-2013
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
Abstract: 
Parthenocarpy is the production of seedless fruits in the absence of pollination and/or
fertilization. This process has been extensively studied in tomato (Solanum lycopersicum
L.) because it offers a method to overcome unfavourable environmental conditions that
reduce pollen production, anther dehiscence and, as a consequence, fruit set.
Among the different sources of genetic parthenocarpy described in tomato, the
parthenocarpic fruit (pat) mutation, object of the thesis, is of particular interest because of
its strong expressivity, high fruit set and enhanced fruit quality.
Previous studies have thoroughly characterized the pat mutation from the genetic,
biochemical and qualitative standpoint. More recent research described the complexity of
the pat syndrome, which associates a strong competence for parthenocarpy with a complex
floral phenotype, involving stamen (reduced length and carpelloid features) and ovule
(arrested integument growth and loss of viability) development.
By a positional cloning approach, the Pat locus was mapped on the long arm of
chromosome 3 and recently, by a candidate gene approach, nine candidates have been
addressed as potentially responsible for the mutant phenotype. Among them, four genes,
known to be involved in reproductive processes, were sequenced in the wild type (WT) and
near-isogenic pat line. After sequencing, a single point mutation was found only in the
tomato ortholog of ATHB15, also known as CORONA (CNA) or INCURVATA4 (ICU4), in
Arabidopsis. ATHB15/CNA/ICU4 is a transcription factor (TF) belonging to the class III HDZip
subfamily protein. Accordingly to this finding, in tomato, we named this gene Solanum
lycopersicum HB15 (SlHB15).
Starting from this background, the thesis aimed to confirm that SlHB15 is involved in
biological processes that, if deregulated, could lead to parthenocarpy and to highlight
differentially expressed genes in the WT and pat ovary during fruit set.
Using different bioinformatic tools, the amino acid substitution found in the SlHB15 protein
encoded by the pat allele was predicted to be not tolerated for the protein function. In
addition, following an in silico comparative approach between ATHB15/CNA/ICU4 in
Arabidopsis and SlHB15 in tomato, interesting highlights about its involvement in the
regulation of auxin homeostasis in plant tissues and biological processes (e.g. flower
development and fruit set) were found (Chapter 2).
So far, RNA interference and complementation experiments performed for the genetic
confirmation of the mutation were not definitive, but promising observations of putatively
SlHB15-silenced plants reinforced the hypothesis that SlHB15 underlies the pat mutation.
Furthermore, in order to find phenotypic similarities between pat and single mutants for its
ortholog ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis, a characterization of the cna-1 (loss-ofii
function) and icu4-1 (gain-of-function) mutants for this gene, was performed. Interestingly,
pleiotropic effects showed by pat (e.g. deviation of the number of cotyledons and aberrant
ovules) and parthenocarpy, were also observed in these mutants, indicating again that
SlHB15 could represent the locus of the pat mutation (Chapter 3).
A microarray experiment was performed in order to identify differentially expressed genes
(DEGs) in the WT and pat ovary during fruit set. Based on their expression pattern, the
DEGs were categorized into five groups of clusters representing different biological trends.
One of the groups deserving more attention was named ‘Controlling complex’ and
contained putative negative or positive regulators of fruit set (genes up- or down-regulated
at pre-athesis in the WT ovary and deregulated in the pat mutant). Interesting genes
belonging to this group encoded tomato orthologs of Arabidopsis TFs regulating the
meristem differentiation and development of floral organs, such as
SHOOTMERISTEMLESS (STM), BIG PETALp (BPEp), AINTEGUMENTA (ANT) and
CRABS CLAW (CRC). These findings represented new insights, because so far these
genes belonging respectively to the KNOX, bHLH, AP2/ERF and YABBY families of TFs
had never been so directly associated to parthenocarpy. Finally, these TFs and other
selected genes were studied also in other pathenocarpic systems (pat-2, pat-3/pat-4, EMSiaa9
and RNAi-ARF7) in order to increase the understanding of parthenocarpy in tomato
and to find homologies between these different sources for such an agronomically
important trait (Chapter 4).
Finally, a genetic interaction study between pat and Curl (Cu), a mutation responsible for
the overexpression of the gene LeT6/TKn2 (tomato ortholog of STM in Arabidopsis) in
vegetative and floral organs, was performed. Overall, the phenotypic and molecular
characterization of the pat Cu double mutant confirmed findings previously reported and
indicated that KNOX family members, such as LeT6/TKn2, may act as negative regulators
of the fruit set (Chapter 5).
Taken together, results obtained from this thesis increased the understanding of the genetic
and molecular bases of fruit set and parthenocarpy in tomato.

La partenocarpia può essere definita come la produzione di frutti senza seme in assenza di
impollinazione e/o fecondazione. Questo processo è stato studiato in maniera estensiva in
pomodoro (Solanum lycopersicum L.) poiché rappresenta un metodo per superare le
avverse condizioni ambientali responsabili di una ridotta produzione di polline, deiscenza
delle antere e di conseguenza dell’allegagione.
Tra le diverse fonti di partenocarpia genetica descritte in pomodoro, la mutazione
parthenocarpic fruit (pat), oggetto di studio della presente tesi, è di particolare interesse in
quanto presenta una forte espressività del carattere ed è responsabile di un’elevata
allegagione con la produzione di frutti qualitativamente migliori.
Studi precedenti hanno caratterizzato la mutazione pat sia da un punto di vista genetico
che biochimico. Mentre, ricerche più recenti descrivono la complessità della sindrome pat,
che associa al carattere di partenocarpia un complesso fenotipo fiorale legato allo sviluppo
degli stami (lunghezza ridotta e caratteristiche carpelloidi) e degli ovuli (perdita di vitalità
dovuta ad un arresto della crescita del tegumento).
Attraverso un approccio di clonaggio posizionale, il locus della mutazione pat è stato
collocato sul braccio lungo del cromosoma 3 e di recente, attraverso un approccio per geni
candidati, nove geni sono stati indicati come potenziali responsabili del fenotipo mutante.
Quattro di essi, coinvolti in meccanismi riproduttivi, sono stati sequenziati sia nella linea
wild type (WT) che nella quasi-isogenica pat. Dopo tale sequenziamento, una singola
mutazione puntiforme è stata trovata nel gene ortologo di pomodoro ad ATHB15,
conosciuto anche come CORONA (CNA) o INCURVATA4 (ICU4), in Arabidopsis.
ATHB15/CNA/ICU4 codifica per un fattore di trascrizione (TF) che appartiene alla classe III
della sottofamiglia di proteine HD-Zip. In pomodoro, il gene è stato chiamato Solanum
lycopersicum HB15 (SlHB15).
A partire da queste informazioni, la tesi ha avuto come scopo quello di: (i) confermare che
SlHB15 è coinvolto in processi biologici che, se deregolati, inducono partenocarpia; (ii)
mettere in evidenza geni differenzialmente espressi nell’ovario WT e pat durante il
processo di allegagione.
Utilizzando diverse risorse bioinformatiche, la sostituzione amminoacidica presente nella
proteina SlHB15, codificata dall’allele pat, è stata predetta essere non tollerata per la sua
funzione. Inoltre, attraverso un altro approccio in silico di tipo comparativo tra
ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis e SlHB15 in pomodoro, sono stati trovati interessanti
suggerimenti riguardo al coinvolgimento di tale gene nella regolazione dell’auxina in diversi
tessuti e durante differenti processi biologici, come per esempio lo sviluppo fiorale ed
l’allegagione (Capitolo 2).
iv
Per la conferma genetica della mutazione sono stati eseguiti degli esperimenti di RNA
interference e complementazione. Finora, tali esperimenti non hanno portato a dei risultati
definitivi, anche se l’osservazione promettente di piante putativamente silenziate avvalora
l’ipotesi che SlHB15 possa rappresentare il gene candidato per la mutazione pat. Inoltre,
per confermare ulteriormente tale ipotesi e cercare delle similarità a livello fenotipico tra pat
e mutanti singoli per ATHB15/CNA/ICU4 in Arabidopsis, è stata eseguita una
caratterizzazione dei mutanti cna-1 (loss-of-function) e icu4-1 (gain-of-function) per tale
gene. È stato molto interessante notare che entrambi i mutanti singoli per
ATHB15/CNA/ICU4 hanno mostrato dei fenotipi paralleli a quelli dalla mutazione pat in
pomodoro, come ad esempio la deviazione del numero di cotiledoni, ovuli aberranti e
partenocarpia (Capitolo 3).
Con lo scopo poi di identificare geni differenzialmente espressi (DEGs), nell’ovario WT e
pat, è stato condotto un esperimento microarray. In base al loro pattern di espressione, i
DEGs sono stati categorizzati in cinque gruppi di clusters rappresentanti differenti
andamenti biologici. Uno dei gruppi che ha destato notevole interesse, definito ‘Controlling
complex’, conteneva dei putativi regolatori negativi o positivi dell’allegagione (geni sovra o
sotto-regolati allo stadio di pre-antesi nell’ovario WT e deregolati in pat). In tale gruppo
sono stati trovati geni codificanti in pomodoro per ortologhi a TFs di Arabidopsis coinvolti
nella differenziazione del meristema e nello sviluppo degli organi fiorali, come ad esempio
SHOOTMERISTEMLESS (STM), BIG PETALp (BPEp), AINTEGUMENTA (ANT) e CRABS
CLAW (CRC). Questi risultati rappresentano una novità, poiché tali TFs non erano mai stati
associati così direttamente a fenomeni di partenocarpia. L’espressione di questi ed altri
geni, selezionati dall’analisi trascrittomica, è stata studiata anche in altri sistemi
partenocarpici (pat-2, pat-3/pat-4, EMS-iaa9 e RNAi-ARF7) con lo scopo di aumentare la
comprensione dell’allegagione e trovare omologie tra queste differenti fonti di partenocarpia
in pomodoro (Capitolo 4).
Infine, è stato condotto uno studio dell’interazione genetica tra pat e Curl (Cu), una
mutazione dominante responsabile per la sovra-espressione del gene LeT6/TKn2 (ortologo
in pomodoro del gene STM di Arabidopsis) in organi vegetativi e fiorali. Complessivamente,
la caratterizzazione fenotipica e molecolare del doppio mutante pat Cu ha confermato dei
risultati precedenti che indicavano LeT6/TKn2 come un importante regolatore negativo
dell’allegagione (Capitolo 5).
Presi assieme, i risultati ottenuti nella presente tesi hanno aumentato la conoscenza delle
basi genetiche e molecolari dell’allegagione e della partenocarpia in pomodoro.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2816
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