Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2798
Title: Verifica della qualità sanitaria del materiale micropropagato attraverso metodi molecolari: controllo e risanamento da virosi in ranuncolo
Other Titles: Evaluation of the sanitary quality of micropropagated material by molecular methods: control and viral diseases eradication in buttercup
Authors: Sacco, Ermanno Domenico
Keywords: Ranunculus;Micropropagazione;Rizoma;ELISA;RT-PCR;Meristema;Micropropagation;Rhizome;Meristem;AGR/04
Issue Date: 20-Jun-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo
Abstract: 
Il ranuncolo (Ranunculus asiaticus L.) è un’apprezzata pianta ornamentale utilizzata per la vendita del fiore reciso e per la produzione di piante in vaso o da giardino. Negli ultimi anni, è risultato essere una specie floricola di importanza nel mercato nazionale ed internazionale grazie all’aumento della gamma varietale disponibile (Elegance® e Festival®), sia per quanto riguarda i colori che le forme (dal fiore semplice a quello doppio) e all’allungamento del periodo di presenza sul mercato. Nel settore florovivaistico la produzione di materiale di propagazione sano ed in particolare esente da virus è però estremamente importante per il mantenimento dell’affidabilità commerciale dei produttori; infatti, la presenza, anche in minime quantità, di virus nel materiale propagativo è destinata a perpetuarsi e a sminuire inesorabilmente la qualità della coltura. La diagnosi precoce e sicura dell’infezione da virus, sul materiale vegetale destinato alla propagazione vegetativa, è fase essenziale per il mantenimento della qualità sanitaria. Gli ibridi di ranuncolo sono suscettibili all’infezione di almeno tredici diversi virus, molto spesso presenti in infezione mista, e in gran parte associati a malattie economicamente importanti. La presente ricerca di Dottorato ha avuto come obiettivo la definizione di un protocollo di diagnosi molecolare definitivo, valido e veloce per l’identificazione e per il risanamento di virosi in ranuncolo; a tal proposito su campioni di ranuncolo individuati attraverso una prima diagnosi visiva di sintomi riconducibili a virosi, è stata effettuata un’analisi comparata tra diversi sistemi di diagnosi delle malattie virali: il sistema sierologico ELISA e il sistema molecolare basato su reverse transcription PCR (RT-PCR) e primers specifici per i singoli virus valutandone l’affidabilità e la sensibilità ed è stata affrontata la definizione di un protocollo multiplex RT-PCR per il rilevamento simultaneo dei virus diagnosticati con più frequenza al fine di razionalizzare ulteriormente i metodi diagnostici. In ultimo sono stati risanati con successo cloni di ranuncolo virosati attraverso un protocollo di risanamento che ha previsto il prelievo e la coltura in vitro di meristemi. Al fine di aumentare la produttività in vitro con conseguente riduzione dei costi di produzione è stato, inoltre, adattato il protocollo di propagazione in vitro riportato in letteratura a nuove varietà di ranuncolo e sono stati studiati protocolli di conservazione dei germogli micropropagati a crescita rallentata (Slow Growth Storage) al fine di ridurre marcatamente la frequenza delle periodiche subcolture senza compromettere la vitalità e il potenziale di ricrescita degli espianti in vitro. Sono state prese in esame, infine, nuove metodologie di conservazione valutando la conservazione a medio-lungo termine dei cloni di ranuncolo tramite lo sviluppo ed ingrossamento dei rizomi in vitro.

The buttercup ((Ranunculus asiaticus L.) is a popular ornamental plant used for the sale of cut flowers and the production of garden and potted plants. In the last years, it has proven to be a floricultural species of importance in the national and international market due to the increased varietal range available (Elegance® and Festival®), both with regards to colors and forms (from the simple to the double flower) and to the elongation of the period of presence on market. In horticultural industry the production of healthy propagation material and in particular free from viruses, however, is extremely important for the maintenance of the commercial reliability of producers; in fact, the presence, even in low amount, of virus in the propagation material is destined to perpetuate and inexorably diminish the quality of the crop. The reliable and early diagnosis of virus infection on plant material for the vegetative propagation, is an essential phase for maintaining the sanitary quality. The hybrids of buttercup are susceptible to infection of at least thirteen different viruses, very often present in mixed infection, and mainly associated with economically important diseases. The present Ph.D. research focused on the definition of a definitive, valid and rapid protocol of molecular diagnosis for the identification and eradication of viral diseases in buttercup; in that regard, on samples of buttercup, identified through an initial visual diagnosis of symptoms consistent with viral infections, was carried out a comparative analysis between different system of diagnosis of viral diseases: the serological system ELISA and the molecular system based on reverse transcription PCR (RT-PCR) and specific primers for each virus, assessing the reliability and sensitivity and a protocol was defined for multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of most frequently diagnosed viruses in order to further rationalize the diagnostic methods. Finally in vitro clones of buttercup were successfully remediated through a protocol of virus eradication that provided for the collection and in vitro culture of meristems. In order to increase the in vitro productivity with a consequent reduction of production costs, the protocol of in vitro propagation, reported in literature, was also adapted to new varieties of buttercup and were investigated protocols of conservation in slow growth of micropropagated shoots in order to markedly reduce the frequency of periodic subcoltures without compromising the viability and the regrowth potential of the in vitro explants. Finally new methodologies were studied to evaluate the medium to long term conservation of buttercup clones through the development and enlargement of the in vitro rhizomes.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ortoflorofrutticoltura
URI: http://hdl.handle.net/2067/2798
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