Immune system and central nervous system crosstalk: focus on IL-18 in neurodegenerative and psychiatric diseases

Abstract

In recent times, researchers are focusing more of their attention on the crosstalk between the immune system (IS) and the central nervous system (CNS). The possibility of active interplay between brain and immunity is increasing, with evidence pointing out that circulating immune signals exert an effect on the brain, and that brain-derived signals, in turn, may influence immune reactions. The interaction element between the molecules of the immune system and CNS components is the blood brain barrier (BBB). In the past, BBB was considered primarily a static barrier which prevented infiltration of immune elements into the brain. Today, BBB is seen as an active regulatory interface which controls the exchange between the brain and the periphery, and is modified and affected by circulating events and by events on the CNS side (McAllister AK, 2009). The study of communication between IS and CNS is particularly crucial in pathological situations. Our understanding of it may help to define the etiology and the clinical progression of a number of diseases, including CNS disturbances. Research at present is aimed at defining the involvement of cytokines as soluble factors which take part in the crosstalk between IS and CNS. In particular, our attention has centered on interleukin (IL)-18, a proinflammatory cytokine that is attracting growing interest for its role in the brain, where it is constitutively present (Sugama S, 2006; Alboni et al, 2010). Furthermore, IL-18 can be up-regulated in aging (Dinarello et al., 2006), as well as in several pathologic conditions, such as neuropathological diseases and psychiatric illness. Of note, an abnormal expression of IL-18 has been observed both centrally and peripherally in progressive neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s disease (Ojala et al., 2009; Bossù et al., 2010) and in some psychiatric disorders affecting both young and aged subjects (Reale et al., 2011). IL-18 is part of a system composed by the same IL-18 and by receptor and soluble molecules. Among the soluble molecules of the system, the most important is the IL-18 2 binding protein (IL-18BP), which is able to inhibit IL-18’s activity. In addition to having neutralizing activity, IL-18BP can also induce a negative feedback regulation of IL-18 production itself, by modulating the strong increase of IL-18 in pathological circumstances (Novick, Schwartsburd, Pinkus et al., 2001). Understanding how the IL-18 system is modulated during neurodegenerative and psychiatric illnesses such as Alzheimer’s disease and schizophrenia may be relevant to the comprehension of inflammatory pathways leading to neurodegeneration and behavioural disturbances. Accordingly, the study I performed during my Ph.D was primarily aimed at identifying IL-18 as a crucial participant in immune-brain crosstalk. The study developed along three main lines: an animal model of chronic neuroinflammation, and two clinical studies: one involving patients with neurodegenerative loss of cognitive functions, the other with psychotic disturbances. Previous studies have shown that animals peripherally treated with a single high dose of the bacterial endotoxin component lipopolysaccharide (LPS) developed a persistent chronic brain inflammation characterized by increased brain levels of TNF-α, accompanied by neuronal death and impacting behavioural/cognitive performances (Qin et al., 2007; Semmler et al., 2007). Thus, in the animal study of my PhD, a single intraperitoneal administration of LPS (5mg/kg) was injected in male rats. After 7 days and again after 10 months from the LPS administration, the rats were subjected to behavioral/cognitive tests and scarified, to evaluate the amount of IL-18 and TNF-α in different brain areas such as frontal cortex, hippocampus, hypothalamus, striatum and cerebellum. The single peripheral administration of a high dose of LPS induced a persistent cognitive/behavioral impairment, characterized by locomotor and motivational/attentional deficits which appeared after 7 days and persisted through 10 months of the treatment. Regarding the brain production of cytokines, TNF-α was significantly elevated in the frontal cortex and hippocampus of rats treated with LPS, in comparison to rats of the control group, appearing after 7 days and persisting after 10 months of the treatment. In addition, TNF-α levels were 3 increased even in the cerebellum 10 months after LPS treatment. On the contrary, IL-18 was persistently induced in frontal cortex, hippocampus and cerebellum only after 10 months from the treatment, thus assuming that this cytokine is involved lately in the inflammatory response. These results suggest that IL-18 is a mediator of immuno-brain crosstalk, and brain IL-18 production may be relevant to chronic neuroinflammation, progressive cognitive impairment and behavioural disturbances. The research has therefore shifted from a study on animals to a clinical setting. To investigate the involvement of IL-18 in the progression of a neurodegenerative disease, we have conducted our study on patients at high risk to develop Alzheimer’s disease (AD). AD is characterized by neurodegeneration, chronic neuroinflammation and progressive loss of cognitive functions. Several studies have highlighted the possible role of this cytokine in AD. In particular, Ojala and colleagues. (Ojala et al., 2009) have done postmortem studies on the brains of AD patients. The studies showed a significant increase of IL-18 in the frontal cortex of patients compared to controls. Moreover, many studies were conducted to determine the effect of IL-18 on the progression of AD. The high levels of this cytokine have been recently correlated with high levels of cognitive impairment (Bossù et al., 2008). It therefore seemed potentially interesting to study the role of IL-18 in cognitive impairment and, particularly, in the pathogenesis of AD. Since AD displays its first symptoms only after the pathology is already established, or specifically when the neuronal loss is already in advanced state, than it is impossible to study the inflammatory parameters in the early stages of pathology on already diagnosed AD patients. To get around this obstacle, the study has been focused on Mild Cognitive Impairment (MCI) subjects who have: 1) a very early state of memory impairment, and 2) a high potential for developing AD. This study has been developed on two levels: one at serum level; and the other one at cellular level. The IL-18 system has been evaluated in the serum of MCI subjects vs. healthy controls (HC). Although there were no significant differences between the serum levels of IL-18 system in the two 4 groups, a significant correlation between serum levels of IL-18BP and cognitive impairment of MCI subjects was identified. Since then, we have continued the work on MCI subjects at a cellular level. In particular, we have evaluated the levels of IL-18 and of other proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-1β) in the cell supernatants obtained from PBMC in culture stimulated with LPS (200ng/ml). This study, which was conducted on the MCI subpopulation of amnesic type (divided into amnesic single domain MCI and amnesic multidomain MCI), in comparison with the healthy controls, showed a selective augment of IL-18 in the subpopulation of amnesic single domain MCI. This subgroup has the highest chance of developing dementia typical of AD. All of these results strongly indicate that IL-18 may be implicated in the early pathological stages of AD, likely playing a role in the progression of cognitive impairment. The last part of my Ph.D study has been focused on investigating the involvement of IL-18 system in the progression of psychotic disorders, in particular schizophrenia (SCZ). It has been theorized that IL-18 may be connected to this illness. In particular, five polymorphisms in genes related to the IL-18 pathway, including IL-18 receptor genes, have been associated with SCZ (Shirts et al., 2008). Furthermore, some variants of the IL-18 gene have been recently related to the development of SCZ symptoms (Liu et al., 2011), and the levels of IL-18 circulating protein have been found to be augmented in affected patients, as compared to those in controls (Tanaka et al., 2000; Reale et al., 2011). The modulation of IL-18 system in SCZ is unknown as yet, and therefore it was interesting to evaluate the level of IL-18 system molecules in the serum of SCZ patients. Indeed, IL-18 system seems to be deregulated in SCZ vs. health controls. In fact, SCZ patients have exhibited a significant raise of both IL-18 and IL-18BP. In particular, the increase of IL-18BP implies that the natural inhibitor of IL-18 is trying to mitigate the pro-inflammatory response of IL-18 likely triggered by the SCZ pathological pathways. As a consequence, the final amount of the active form of IL-18 did not differ between SCZ and HC. Moreover, the IL-18 system seems to be altered in 5 particular in young SCZ, where an increase of the active circulating form of IL-18 was selectively observed. In conclusion, my Ph.D research has highlighted the possible involvement of the pro-inflammatory cytokine IL-18 in brain-to immune cross-talk and in neuropathological conditions. The data suggests that IL-18 may be a key mediator, implicated in the communication between the immune and the central nervous systems, with potential effects on cognitive and behavioral functions. Moreover, the altered modulation of the IL-18 system both in patients at high risk of developing AD and in young SCZ subjects puts forth the notion that IL-18 may intervene early in connecting IS with CNS by means of inflammatory functions which would impact on the pathophysiological processes underlying neurodegenerative and psychotic disturbances. These findings confirm the need for further elucidation on the role of IL-18 in CNS pathological conditions, with the aim of identifying innovative diagnostic and therapeutic procedures for these devastating diseases.

Negli ultimi tempi, la ricerca sta incentrando sempre di più l’attenzione su crosstalk che intercorre tra il sistema immune e il sistema nervoso centrale. La possibilità infatti che esista un attivo scambio di informazioni tra questi due sistemi è in costante aumento grazie a numerose prove che mostrano come molecole del sistema immune abbiano un’influenza a livello centrale e come a sua volta, input cerebrali possano influenzare reazioni immunitarie. Il principale elemento che permette l’interazione tra le molecole del sistema immune e quelle del sistema nervoso centrale è la barriera emato-encefalica. Fino a qualche tempo fa, si credeva che questa fosse una barriera statica che preservasse il cervello da possibili infiltrazioni immunitarie. Oggigiorno questa ideologia è andata mutandosi in quanto la visione della barriera ematoencefalica è di un’attiva interfaccia che controlla e regola lo scambio tra cervello e periferia. In circostanze patologiche è però soggetta a numerose modifiche morfologiche e strutturali sia dal versante circolatorio che da quello cerebrale (McAllister, 2009). Studiare quindi il crosstalk tra il sistema immune e il sistema nervoso centrale sembrerebbe essere particolarmente interessante proprio in situazioni patologiche. Capire più in dettaglio come avviene lo scambio di informazioni tra questi, che sono due principali sistemi che controllano l’organismo, potrebbe aiutare a comprendere sia l’eziologia che la progressione clinica di moltissime patologie. La ricerca corrente sta indagando sul possibile coinvolgimento delle citochine come fattori solubili nel crosstalk tra sistema immune e sistema nervoso centrale. In particolare, durante il mio Ph.D abbiamo focalizzato l’attenzione sull’interleuchina (IL)-18, una citochina pro-infiammatoria inizialmente nota per la sua attività nella risposta immune a livello periferico. Recentemente è emerso che questa citochina è costitutivamente presente a livello cerebrale (Sugama S, 2006; Alboni et al., 2010) ed è up-regolata durante i processi di invecchiamento (Dinarello et al., 2006) e in numerose condizioni patologiche tra le quali patologie neurodegenerative e disturbi psicotici. 2 IL-18 fa parte di un complesso sistema composto da diverse molecole sia recettoriali che solubili. Tra queste ultime, probabilmente quella che ha una maggiore rilevanza da un punto di vista biologico è IL-18 binding protein (IL- 18BP). Questa infatti, svolge un’attività sia neutralizzante verso IL-18, inibendone quindi l’attività, sia modulatoria verso la stessa, regolandone la produzione attraverso una regolazione a feedback negativo. IL-18BP modula quindi il considerevole aumento di IL-18 che si riscontra soprattutto in diverse situazioni patologiche (Novick, Schwartsburd, Pinkus et al., 2001). Comprendere quindi come IL-18/IL-18BP vengano modulate durante patologie nervose caratterizzate da una componente immunitaria, come la malattia di Alzheimer e la schizofrenia, potrebbe essere interessante per comprendere i pathway infiammatori che portano sia alla neurodegenerazione che ai disturbi comportamentali. Per questa ragione, lo studio condotto durante il mio Ph.D, è stato finalizzato ad valutare la modulazione di IL-18 e IL-18BP in diverse circostanze biologiche. Il mio studio si è sviluppato attraverso tre principali linee di ricerca ovvero attraverso uno studio sperimentale su un modello animale di neuroinfiammazione cronica e attraverso due studi clinici, uno su pazienti con ridotte capacità cognitive e l’atro su pazienti con disturbi psicotici. Nello studio sperimentale, ratti maschi del ceppo Wistar sono stati iniettati con una singola somministrazione intraperitoneale con un’alta dose (5mg/kg) di lipopolisaccaride (LPS). Precedenti studi hanno mostrato come una singola somministrazione periferica di LPS sia in grado di indurre negli animali non solo una neuroinfiammazione cronica, apprezzata grazie alla valutazione cerebrale di alti livelli di TNF-α, ma anche morte neuronale incidendo sulle prestazioni comportamentali e cognitive (Qin et al., 2007; Semmler et al., 2007). I ratti trattati nel mio studio, sono stati prima sottoposti a test comportamentali e cognitivi e poi sacrificati a 7 giorni e a 10 mesi dalla somministrazione di LPS per poter valutare la quantità di IL-18 e TNF-α in diverse aree cerebrali, quali: corteccia frontale, ippocampo, ipotalamo, striato e cervelletto. Una singola somministrazione periferica con un’alta dose di LPS induce un persistente 3 danneggiamento cognitivo/comportamentale, caratterizzato da deficit locomotori e motivazionali/attentivi che compaiono dopo soli 7 giorni e persistono fino a 10 mesi dal trattamento. L’LPS oltre ad avere delle conseguenze dal punto di vista comportamentale, sembrerebbe avere degli effetti anche riguardo la produzione cerebrale di citochine. Il TNF-α infatti, è risultato significativamente elevato nella corteccia frontale e nell’ippocampo dei ratti trattati rispetto ai ratti del gruppo di controllo, già dopo 7 giorni e persistendo anche dopo 10 mesi dal trattamento con LPS. Inoltre, i livelli di questa citochina sono risultati aumentati anche nel cervelletto dopo 10 mesi dal trattamento. Differentemente dal TNF-α, IL-18 risulta elevata nella corteccia frontale, nell’ippocampo e nel cervelletto solo dopo 10 mesi dal trattamento con LPS, facendoci supporre quindi che questa citochina partecipi tardivamente alla risposta infiammatoria. IL-18 quindi sembrerebbe essere è un mediatore del crosstalk tra immunità e cervello e la produzione cerebrale di questa citochina potrebbe essere rilevante per la neuroinfiammazione cronica, che potrebbe essere la responsabile del progressivo deficit cognitivo e dei disturbi comportamentali che abbiamo osservato negli animali trattati. IL-18 potrebbe quindi partecipare a questi deficit ed è sembrato quindi molto interessante proseguire lo studio in questa direzione, investigando sulla possibile modulazione di questa citochina in patologie caratterizzate da deficit cognitivi e disturbi comportamentali. La ricerca quindi, da uno studio sperimentale su animali si è spostata su studi clinici. Il primo studio clinico è stato condotto al fine di indagare il possibile coinvolgimento di IL-18 nella progressione del deficit cognitivo proprio di una patologia neurodegenerativa quale la malattia di Alzheimer. Questa patologia è caratterizzata da neurodegenerazione, neuroinfiammazione cronica e da una progressiva perdita di funzioni cognitive. Diversi studi hanno mostrato il possibile coinvolgimento di IL-18 nella malattia di Alzheimer. In particolare, Ojala et al. (Ojala et al., 2009) hanno condotto studi post-mortem su cervelli di pazienti Alzheimer mostrando un significativo aumento di IL-18 a livello nella corteccia frontale. Altri studi sono stati condotti per determinare la possibile relazione tra IL-18 i il deficit cognitivi esibiti dai pazienti Alzheimer 4 mostrando una correlazione tra i livelli di questa citochina e la gravità del deficit cognitivo (Bossù et al., 2008). In base ai dati presenti in letteratura, è sembrato interessante studiare il coinvolgimento non solo di IL-18 ma anche di IL-18BP negli stadi potenzialmente patogenetici alla malattia di Alzheimer, per valutare la possibile correlazione tra il sistema di IL-18 e il deficit cognitivo nei primi stadi di malattia. Studiare i primi stadi di malattia risulta però impossibile nei pazienti Alzheimer in quanto, quando questi esibiscono i primi sintomi, la neurodegenerazione, la neuroinfiammazione e quindi la stessa patologia si trovano già in uno stadio avanzato. Per arginare questo ostacolo, lo studio è stato condotto su soggetti Mild Cognitive Impairment (MCI) che non solo mostrano un stadio molto precoce di deficit mnestico ma hanno anche un’alta probabilità di sviluppare l’Alzheimer. Questo studio è stato sviluppato su due livelli: a livello del siero e livello cellulare. Il sistema di IL-18 è stato valutato nel siero dei soggetti MCI in relazione a soggetti sani di controllo. Nonostante non sia stata rilevata nessuna differenza significativa tra i livelli sierici per le molecole solubili che compongono il sistema di IL-18 nei due gruppi considerati, è stata ritrovata una significativa correlazione tra i livelli sierici di IL-18BP e il deficit cognitivo esibito dei soggetti MCI. Da questo abbiamo quindi proseguito il lavoro a livello cellulare. In particolare, abbiamo valutato i livelli di IL-18 e di altre citochine pro-infiammatorie (TNF- α e IL-1β) nei supernatanti cellulari ottenuti da PBMC posti in coltura e stimolati con LPS (200 ng/ml). Questo studio, condotto su soggetti sani di controllo e sulle sottopopolazioni di MCI amnesici (MCI amnesici a singolo dominio e MCI amnesici multi dominio), ha mostrato un selettivo aumento di IL-18 nella sottopopolazione di MCI (MCI amnesici a singolo dominio) che ha la particolarità di avere un’alta probabilità di sviluppare la demenza tipica della patologia di Alzheimer. Questi risultati, mostrano che il sistema di IL-18 potrebbe avere un’implicazione nei probabili stadi patogenetici dell’Alzheimer, giocando molto probabilmente un ruolo nella progressione del deficit cognitivo. 5 A questo punto è sembrato interessante indagare il possibile coinvolgimento del sistema di IL-18 nella progressione della schizofrenia che è una patologia caratterizzata da una sintomatologia psicotica. L’ultima parte dello studio del mio Ph.D è stato quindi focalizzato sull’investigare la modulazione di IL-18 e di IL-18BP in questa patologia. Studi presenti in letteratura hanno ipotizzato la possibile connessione di IL-18 con questo disturbo. In particolare, sono stati associati alla schizofrenia cinque polimorfismi nei geni connessi al pathway di IL-18 inclusi i geni per i recettori di questa citochina (Shirts et al., 2008). Inoltre, alcune varianti geniche di IL-18 sono state recentemente legate allo sviluppo dei sintomi schizofrenici (Lui et al., 2011), e i livelli circolanti della proteina IL-18 sono stati trovati aumentati nei pazienti affetti in relazione a soggetti sani di controllo (Tanaka et al., 2000; Reale et al., 2011). Nonostante ciò, la modulazione del sistema di IL-18 nella schizofrenia risulta ancora sconosciuta e per questo motivo, è sembrato interessante valutare i livelli di IL-18 e IL-18BP nel siero dei pazienti schizofrenici. In base ai dati da noi ottenuti, il sistema di IL-18 sembrerebbe essere deregolato nel siero dei pazienti schizofrenici in quanto mostrano un significativo aumento sia di IL-18 che di IL-18 BP rispetto ai soggetti sani di controllo. L’aumento di IL-18BP sembrerebbe essere spiegato dal fatto che l’inibitore naturale di IL-18 molto probabilmente tenti di modulare la risposta pro-infiammatoria di IL-18 tanto che la quantità di IL-18 nella forma attiva non differisce tra schizofrenici e soggetti di controllo. Inoltre, il sistema di IL-18 sembrerebbe essere alterato in particolare negli schizofrenici giovani, dove è stato osservato un selettivo aumento di IL-18 a livello del siero. In conclusione, la ricerca condotta durante il mio Ph.D, ha mostrato il possibile coinvolgimento della citochina pro-infiammatoria IL-18 in diverse situazioni neuropatologiche. I risultati ottenuti, suggeriscono che IL-18 potrebbe essere un mediatore chiave, implicato nella comunicazione tra sistema immune e sistema nervoso centrale, con effetti rilevanti anche nelle funzioni cognitive e comportamentali. Inoltre, l’alterata modulazione del sistema di IL-18 sia in pazienti con alto rischio di sviluppare l’Alzheimer, sia in giovani soggetti schizofrenici, porta a 6 ipotizzare che IL-18 potrebbe intervenire precocemente nella comunicazione tra sistema immune e cervello facendo pensare che le funzioni infiammatorie potrebbero avere un effetto sui processi patofisiologici che sottendono i disturbi neurodegenerativi e psicotici. Questi risultati confermano l’interesse per future delucidazioni sul ruolo di IL-18 in patologie che colpiscono il sistema nervoso centrale, con il fine di identificare innovative procedure, diagnostiche e terapeutiche per queste devastanti patologie.