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Title: Immune system and central nervous system crosstalk: focus on IL-18 in neurodegenerative and psychiatric diseases
Other Titles: Interazione tra il sistema immune e il sistema nervoso centrale incentrata su IL-18 in patologie neurodegenerative e psichiatriche
Authors: Palladino, Ilaria
Keywords: Interleukin-18;IL-18;Inflammation;Cognitive deficit;Infiammazione;Disturbi cognitivi;BIO/13
Issue Date: 31-May-2013
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
Abstract: 
In recent times, researchers are focusing more of their attention on the
crosstalk between the immune system (IS) and the central nervous system
(CNS). The possibility of active interplay between brain and immunity is
increasing, with evidence pointing out that circulating immune signals exert
an effect on the brain, and that brain-derived signals, in turn, may influence
immune reactions.
The interaction element between the molecules of the immune system and
CNS components is the blood brain barrier (BBB). In the past, BBB was
considered primarily a static barrier which prevented infiltration of immune
elements into the brain. Today, BBB is seen as an active regulatory interface
which controls the exchange between the brain and the periphery, and is
modified and affected by circulating events and by events on the CNS side
(McAllister AK, 2009).
The study of communication between IS and CNS is particularly crucial in
pathological situations. Our understanding of it may help to define the
etiology and the clinical progression of a number of diseases, including
CNS disturbances.
Research at present is aimed at defining the involvement of cytokines as
soluble factors which take part in the crosstalk between IS and CNS. In
particular, our attention has centered on interleukin (IL)-18, a proinflammatory
cytokine that is attracting growing interest for its role in the
brain, where it is constitutively present (Sugama S, 2006; Alboni et al,
2010). Furthermore, IL-18 can be up-regulated in aging (Dinarello et al.,
2006), as well as in several pathologic conditions, such as neuropathological
diseases and psychiatric illness. Of note, an abnormal expression of IL-18
has been observed both centrally and peripherally in progressive
neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s disease (Ojala et al.,
2009; Bossù et al., 2010) and in some psychiatric disorders affecting both
young and aged subjects (Reale et al., 2011). IL-18 is part of a system
composed by the same IL-18 and by receptor and soluble molecules.
Among the soluble molecules of the system, the most important is the IL-18
2
binding protein (IL-18BP), which is able to inhibit IL-18’s activity. In
addition to having neutralizing activity, IL-18BP can also induce a negative
feedback regulation of IL-18 production itself, by modulating the strong
increase of IL-18 in pathological circumstances (Novick, Schwartsburd,
Pinkus et al., 2001). Understanding how the IL-18 system is modulated
during neurodegenerative and psychiatric illnesses such as Alzheimer’s
disease and schizophrenia may be relevant to the comprehension of
inflammatory pathways leading to neurodegeneration and behavioural
disturbances.
Accordingly, the study I performed during my Ph.D was primarily aimed at
identifying IL-18 as a crucial participant in immune-brain crosstalk. The
study developed along three main lines: an animal model of chronic
neuroinflammation, and two clinical studies: one involving patients with
neurodegenerative loss of cognitive functions, the other with psychotic
disturbances.
Previous studies have shown that animals peripherally treated with a single
high dose of the bacterial endotoxin component lipopolysaccharide (LPS)
developed a persistent chronic brain inflammation characterized by
increased brain levels of TNF-α, accompanied by neuronal death and
impacting behavioural/cognitive performances (Qin et al., 2007; Semmler et
al., 2007). Thus, in the animal study of my PhD, a single intraperitoneal
administration of LPS (5mg/kg) was injected in male rats. After 7 days and
again after 10 months from the LPS administration, the rats were subjected
to behavioral/cognitive tests and scarified, to evaluate the amount of IL-18
and TNF-α in different brain areas such as frontal cortex, hippocampus,
hypothalamus, striatum and cerebellum. The single peripheral
administration of a high dose of LPS induced a persistent
cognitive/behavioral impairment, characterized by locomotor and
motivational/attentional deficits which appeared after 7 days and persisted
through 10 months of the treatment.
Regarding the brain production of cytokines, TNF-α was significantly
elevated in the frontal cortex and hippocampus of rats treated with LPS, in
comparison to rats of the control group, appearing after 7 days and
persisting after 10 months of the treatment. In addition, TNF-α levels were
3
increased even in the cerebellum 10 months after LPS treatment. On the
contrary, IL-18 was persistently induced in frontal cortex, hippocampus and
cerebellum only after 10 months from the treatment, thus assuming that this
cytokine is involved lately in the inflammatory response.
These results suggest that IL-18 is a mediator of immuno-brain crosstalk,
and brain IL-18 production may be relevant to chronic neuroinflammation,
progressive cognitive impairment and behavioural disturbances.
The research has therefore shifted from a study on animals to a clinical
setting. To investigate the involvement of IL-18 in the progression of a
neurodegenerative disease, we have conducted our study on patients at high
risk to develop Alzheimer’s disease (AD). AD is characterized by
neurodegeneration, chronic neuroinflammation and progressive loss of
cognitive functions. Several studies have highlighted the possible role of
this cytokine in AD.
In particular, Ojala and colleagues. (Ojala et al., 2009) have done postmortem
studies on the brains of AD patients. The studies showed a
significant increase of IL-18 in the frontal cortex of patients compared to
controls. Moreover, many studies were conducted to determine the effect of
IL-18 on the progression of AD. The high levels of this cytokine have been
recently correlated with high levels of cognitive impairment (Bossù et al.,
2008).
It therefore seemed potentially interesting to study the role of IL-18 in
cognitive impairment and, particularly, in the pathogenesis of AD. Since
AD displays its first symptoms only after the pathology is already
established, or specifically when the neuronal loss is already in advanced
state, than it is impossible to study the inflammatory parameters in the early
stages of pathology on already diagnosed AD patients. To get around this
obstacle, the study has been focused on Mild Cognitive Impairment (MCI)
subjects who have: 1) a very early state of memory impairment, and 2) a
high potential for developing AD.
This study has been developed on two levels: one at serum level; and the
other one at cellular level. The IL-18 system has been evaluated in the
serum of MCI subjects vs. healthy controls (HC). Although there were no
significant differences between the serum levels of IL-18 system in the two
4
groups, a significant correlation between serum levels of IL-18BP and
cognitive impairment of MCI subjects was identified.
Since then, we have continued the work on MCI subjects at a cellular level.
In particular, we have evaluated the levels of IL-18 and of other proinflammatory
cytokines (TNF-α and IL-1β) in the cell supernatants obtained
from PBMC in culture stimulated with LPS (200ng/ml). This study, which
was conducted on the MCI subpopulation of amnesic type (divided into
amnesic single domain MCI and amnesic multidomain MCI), in comparison
with the healthy controls, showed a selective augment of IL-18 in the
subpopulation of amnesic single domain MCI. This subgroup has the
highest chance of developing dementia typical of AD.
All of these results strongly indicate that IL-18 may be implicated in the
early pathological stages of AD, likely playing a role in the progression of
cognitive impairment.
The last part of my Ph.D study has been focused on investigating the
involvement of IL-18 system in the progression of psychotic disorders, in
particular schizophrenia (SCZ). It has been theorized that IL-18 may be
connected to this illness. In particular, five polymorphisms in genes related
to the IL-18 pathway, including IL-18 receptor genes, have been associated
with SCZ (Shirts et al., 2008). Furthermore, some variants of the IL-18
gene have been recently related to the development of SCZ symptoms (Liu
et al., 2011), and the levels of IL-18 circulating protein have been found to
be augmented in affected patients, as compared to those in controls (Tanaka
et al., 2000; Reale et al., 2011).
The modulation of IL-18 system in SCZ is unknown as yet, and therefore it
was interesting to evaluate the level of IL-18 system molecules in the serum
of SCZ patients. Indeed, IL-18 system seems to be deregulated in SCZ vs.
health controls. In fact, SCZ patients have exhibited a significant raise of
both IL-18 and IL-18BP. In particular, the increase of IL-18BP implies that
the natural inhibitor of IL-18 is trying to mitigate the pro-inflammatory
response of IL-18 likely triggered by the SCZ pathological pathways. As a
consequence, the final amount of the active form of IL-18 did not differ
between SCZ and HC. Moreover, the IL-18 system seems to be altered in
5
particular in young SCZ, where an increase of the active circulating form of
IL-18 was selectively observed.
In conclusion, my Ph.D research has highlighted the possible involvement
of the pro-inflammatory cytokine IL-18 in brain-to immune cross-talk and
in neuropathological conditions. The data suggests that IL-18 may be a key
mediator, implicated in the communication between the immune and the
central nervous systems, with potential effects on cognitive and behavioral
functions.
Moreover, the altered modulation of the IL-18 system both in patients at
high risk of developing AD and in young SCZ subjects puts forth the notion
that IL-18 may intervene early in connecting IS with CNS by means of
inflammatory functions which would impact on the pathophysiological
processes underlying neurodegenerative and psychotic disturbances. These
findings confirm the need for further elucidation on the role of IL-18 in
CNS pathological conditions, with the aim of identifying innovative
diagnostic and therapeutic procedures for these devastating diseases.

Negli ultimi tempi, la ricerca sta incentrando sempre di più l’attenzione su
crosstalk che intercorre tra il sistema immune e il sistema nervoso centrale. La
possibilità infatti che esista un attivo scambio di informazioni tra questi due
sistemi è in costante aumento grazie a numerose prove che mostrano come
molecole del sistema immune abbiano un’influenza a livello centrale e come a
sua volta, input cerebrali possano influenzare reazioni immunitarie.
Il principale elemento che permette l’interazione tra le molecole del sistema
immune e quelle del sistema nervoso centrale è la barriera emato-encefalica.
Fino a qualche tempo fa, si credeva che questa fosse una barriera statica che
preservasse il cervello da possibili infiltrazioni immunitarie. Oggigiorno questa
ideologia è andata mutandosi in quanto la visione della barriera ematoencefalica
è di un’attiva interfaccia che controlla e regola lo scambio tra
cervello e periferia. In circostanze patologiche è però soggetta a numerose
modifiche morfologiche e strutturali sia dal versante circolatorio che da quello
cerebrale (McAllister, 2009). Studiare quindi il crosstalk tra il sistema immune
e il sistema nervoso centrale sembrerebbe essere particolarmente interessante
proprio in situazioni patologiche. Capire più in dettaglio come avviene lo
scambio di informazioni tra questi, che sono due principali sistemi che
controllano l’organismo, potrebbe aiutare a comprendere sia l’eziologia che la
progressione clinica di moltissime patologie.
La ricerca corrente sta indagando sul possibile coinvolgimento delle citochine
come fattori solubili nel crosstalk tra sistema immune e sistema nervoso
centrale. In particolare, durante il mio Ph.D abbiamo focalizzato l’attenzione
sull’interleuchina (IL)-18, una citochina pro-infiammatoria inizialmente nota
per la sua attività nella risposta immune a livello periferico. Recentemente è
emerso che questa citochina è costitutivamente presente a livello cerebrale
(Sugama S, 2006; Alboni et al., 2010) ed è up-regolata durante i processi di
invecchiamento (Dinarello et al., 2006) e in numerose condizioni patologiche
tra le quali patologie neurodegenerative e disturbi psicotici.
2
IL-18 fa parte di un complesso sistema composto da diverse molecole sia
recettoriali che solubili. Tra queste ultime, probabilmente quella che ha una
maggiore rilevanza da un punto di vista biologico è IL-18 binding protein (IL-
18BP). Questa infatti, svolge un’attività sia neutralizzante verso IL-18,
inibendone quindi l’attività, sia modulatoria verso la stessa, regolandone la
produzione attraverso una regolazione a feedback negativo. IL-18BP modula
quindi il considerevole aumento di IL-18 che si riscontra soprattutto in diverse
situazioni patologiche (Novick, Schwartsburd, Pinkus et al., 2001).
Comprendere quindi come IL-18/IL-18BP vengano modulate durante patologie
nervose caratterizzate da una componente immunitaria, come la malattia di
Alzheimer e la schizofrenia, potrebbe essere interessante per comprendere i
pathway infiammatori che portano sia alla neurodegenerazione che ai disturbi
comportamentali.
Per questa ragione, lo studio condotto durante il mio Ph.D, è stato finalizzato ad
valutare la modulazione di IL-18 e IL-18BP in diverse circostanze biologiche.
Il mio studio si è sviluppato attraverso tre principali linee di ricerca ovvero
attraverso uno studio sperimentale su un modello animale di
neuroinfiammazione cronica e attraverso due studi clinici, uno su pazienti con
ridotte capacità cognitive e l’atro su pazienti con disturbi psicotici.
Nello studio sperimentale, ratti maschi del ceppo Wistar sono stati iniettati con
una singola somministrazione intraperitoneale con un’alta dose (5mg/kg) di
lipopolisaccaride (LPS). Precedenti studi hanno mostrato come una singola
somministrazione periferica di LPS sia in grado di indurre negli animali non
solo una neuroinfiammazione cronica, apprezzata grazie alla valutazione
cerebrale di alti livelli di TNF-α, ma anche morte neuronale incidendo sulle
prestazioni comportamentali e cognitive (Qin et al., 2007; Semmler et al.,
2007).
I ratti trattati nel mio studio, sono stati prima sottoposti a test comportamentali
e cognitivi e poi sacrificati a 7 giorni e a 10 mesi dalla somministrazione di LPS
per poter valutare la quantità di IL-18 e TNF-α in diverse aree cerebrali, quali:
corteccia frontale, ippocampo, ipotalamo, striato e cervelletto. Una singola
somministrazione periferica con un’alta dose di LPS induce un persistente
3
danneggiamento cognitivo/comportamentale, caratterizzato da deficit
locomotori e motivazionali/attentivi che compaiono dopo soli 7 giorni e
persistono fino a 10 mesi dal trattamento.
L’LPS oltre ad avere delle conseguenze dal punto di vista comportamentale,
sembrerebbe avere degli effetti anche riguardo la produzione cerebrale di
citochine. Il TNF-α infatti, è risultato significativamente elevato nella corteccia
frontale e nell’ippocampo dei ratti trattati rispetto ai ratti del gruppo di
controllo, già dopo 7 giorni e persistendo anche dopo 10 mesi dal trattamento
con LPS. Inoltre, i livelli di questa citochina sono risultati aumentati anche nel
cervelletto dopo 10 mesi dal trattamento. Differentemente dal TNF-α, IL-18
risulta elevata nella corteccia frontale, nell’ippocampo e nel cervelletto solo
dopo 10 mesi dal trattamento con LPS, facendoci supporre quindi che questa
citochina partecipi tardivamente alla risposta infiammatoria.
IL-18 quindi sembrerebbe essere è un mediatore del crosstalk tra immunità e
cervello e la produzione cerebrale di questa citochina potrebbe essere rilevante
per la neuroinfiammazione cronica, che potrebbe essere la responsabile del
progressivo deficit cognitivo e dei disturbi comportamentali che abbiamo
osservato negli animali trattati. IL-18 potrebbe quindi partecipare a questi
deficit ed è sembrato quindi molto interessante proseguire lo studio in questa
direzione, investigando sulla possibile modulazione di questa citochina in
patologie caratterizzate da deficit cognitivi e disturbi comportamentali.
La ricerca quindi, da uno studio sperimentale su animali si è spostata su studi
clinici. Il primo studio clinico è stato condotto al fine di indagare il possibile
coinvolgimento di IL-18 nella progressione del deficit cognitivo proprio di una
patologia neurodegenerativa quale la malattia di Alzheimer. Questa patologia è
caratterizzata da neurodegenerazione, neuroinfiammazione cronica e da una
progressiva perdita di funzioni cognitive. Diversi studi hanno mostrato il
possibile coinvolgimento di IL-18 nella malattia di Alzheimer.
In particolare, Ojala et al. (Ojala et al., 2009) hanno condotto studi post-mortem
su cervelli di pazienti Alzheimer mostrando un significativo aumento di IL-18 a
livello nella corteccia frontale. Altri studi sono stati condotti per determinare la
possibile relazione tra IL-18 i il deficit cognitivi esibiti dai pazienti Alzheimer
4
mostrando una correlazione tra i livelli di questa citochina e la gravità del
deficit cognitivo (Bossù et al., 2008).
In base ai dati presenti in letteratura, è sembrato interessante studiare il
coinvolgimento non solo di IL-18 ma anche di IL-18BP negli stadi
potenzialmente patogenetici alla malattia di Alzheimer, per valutare la possibile
correlazione tra il sistema di IL-18 e il deficit cognitivo nei primi stadi di
malattia. Studiare i primi stadi di malattia risulta però impossibile nei pazienti
Alzheimer in quanto, quando questi esibiscono i primi sintomi, la
neurodegenerazione, la neuroinfiammazione e quindi la stessa patologia si
trovano già in uno stadio avanzato. Per arginare questo ostacolo, lo studio è
stato condotto su soggetti Mild Cognitive Impairment (MCI) che non solo
mostrano un stadio molto precoce di deficit mnestico ma hanno anche un’alta
probabilità di sviluppare l’Alzheimer.
Questo studio è stato sviluppato su due livelli: a livello del siero e livello
cellulare. Il sistema di IL-18 è stato valutato nel siero dei soggetti MCI in
relazione a soggetti sani di controllo. Nonostante non sia stata rilevata nessuna
differenza significativa tra i livelli sierici per le molecole solubili che
compongono il sistema di IL-18 nei due gruppi considerati, è stata ritrovata una
significativa correlazione tra i livelli sierici di IL-18BP e il deficit cognitivo
esibito dei soggetti MCI.
Da questo abbiamo quindi proseguito il lavoro a livello cellulare. In particolare,
abbiamo valutato i livelli di IL-18 e di altre citochine pro-infiammatorie (TNF-
α e IL-1β) nei supernatanti cellulari ottenuti da PBMC posti in coltura e
stimolati con LPS (200 ng/ml). Questo studio, condotto su soggetti sani di
controllo e sulle sottopopolazioni di MCI amnesici (MCI amnesici a singolo
dominio e MCI amnesici multi dominio), ha mostrato un selettivo aumento di
IL-18 nella sottopopolazione di MCI (MCI amnesici a singolo dominio) che ha
la particolarità di avere un’alta probabilità di sviluppare la demenza tipica della
patologia di Alzheimer.
Questi risultati, mostrano che il sistema di IL-18 potrebbe avere
un’implicazione nei probabili stadi patogenetici dell’Alzheimer, giocando
molto probabilmente un ruolo nella progressione del deficit cognitivo.
5
A questo punto è sembrato interessante indagare il possibile coinvolgimento del
sistema di IL-18 nella progressione della schizofrenia che è una patologia
caratterizzata da una sintomatologia psicotica. L’ultima parte dello studio del
mio Ph.D è stato quindi focalizzato sull’investigare la modulazione di IL-18 e
di IL-18BP in questa patologia. Studi presenti in letteratura hanno ipotizzato la
possibile connessione di IL-18 con questo disturbo. In particolare, sono stati
associati alla schizofrenia cinque polimorfismi nei geni connessi al pathway di
IL-18 inclusi i geni per i recettori di questa citochina (Shirts et al., 2008).
Inoltre, alcune varianti geniche di IL-18 sono state recentemente legate allo
sviluppo dei sintomi schizofrenici (Lui et al., 2011), e i livelli circolanti della
proteina IL-18 sono stati trovati aumentati nei pazienti affetti in relazione a
soggetti sani di controllo (Tanaka et al., 2000; Reale et al., 2011).
Nonostante ciò, la modulazione del sistema di IL-18 nella schizofrenia risulta
ancora sconosciuta e per questo motivo, è sembrato interessante valutare i
livelli di IL-18 e IL-18BP nel siero dei pazienti schizofrenici. In base ai dati da
noi ottenuti, il sistema di IL-18 sembrerebbe essere deregolato nel siero dei
pazienti schizofrenici in quanto mostrano un significativo aumento sia di IL-18
che di IL-18 BP rispetto ai soggetti sani di controllo. L’aumento di IL-18BP
sembrerebbe essere spiegato dal fatto che l’inibitore naturale di IL-18 molto
probabilmente tenti di modulare la risposta pro-infiammatoria di IL-18 tanto
che la quantità di IL-18 nella forma attiva non differisce tra schizofrenici e
soggetti di controllo. Inoltre, il sistema di IL-18 sembrerebbe essere alterato in
particolare negli schizofrenici giovani, dove è stato osservato un selettivo
aumento di IL-18 a livello del siero.
In conclusione, la ricerca condotta durante il mio Ph.D, ha mostrato il possibile
coinvolgimento della citochina pro-infiammatoria IL-18 in diverse situazioni
neuropatologiche. I risultati ottenuti, suggeriscono che IL-18 potrebbe essere un
mediatore chiave, implicato nella comunicazione tra sistema immune e sistema
nervoso centrale, con effetti rilevanti anche nelle funzioni cognitive e
comportamentali.
Inoltre, l’alterata modulazione del sistema di IL-18 sia in pazienti con alto
rischio di sviluppare l’Alzheimer, sia in giovani soggetti schizofrenici, porta a
6
ipotizzare che IL-18 potrebbe intervenire precocemente nella comunicazione tra
sistema immune e cervello facendo pensare che le funzioni infiammatorie
potrebbero avere un effetto sui processi patofisiologici che sottendono i disturbi
neurodegenerativi e psicotici. Questi risultati confermano l’interesse per future
delucidazioni sul ruolo di IL-18 in patologie che colpiscono il sistema nervoso
centrale, con il fine di identificare innovative procedure, diagnostiche e
terapeutiche per queste devastanti patologie.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/2753
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