Cost effective manufacturing methods for Public Health vaccines against Gram negative bacteria

Abstract

Infectious diseases, particularly in less developed countries, remain among the leading causes of global mortality, most of these infections are caused by Gram-negative bacteria which are the major pathogens responsible of neonatal sepsis and cause of a range of diarrheal, respiratory and invasive diseases. The most frequent Gram-negative isolates are E.coli, Salmonella spp and Shigella spp. Salmonella infection represents a considerable burden in both developing and developed countries. Efforts to reduce transmission of salmonellae by food and other routes must be implemented on a global scale thus the development of cost effective, needle-independent vaccines is a high priority. Vaccine for Developing Countries should be designed to be inexpensive (less than one euro for association like UNICEF and GAVI), stable at room temperature, simple to administer to infants, readily administered by nonprofessionals using a needle-free method and the vaccines formulation would protect against multiple agents. Novartis Vaccines Institute for Global Health (NVGH) aims to develop a broadly protective vaccine using outer membrane particles. These particles, called Generalized Modules for Membrane Antigens (GMMA), also known as outer membrane vesicles (OMV), are naturally shed from the surface of living Gram‐negative bacteria. GMMA are different from the detergent‐extracted OMV which are depleted of lipooligosaccharides and lipoproteins. The purpose of this PhD project was to investigate the possibility to develop low cost vaccines applicable to Gram-negative strains, intended for neglected infectious diseases of impoverished communities, using the GMMA technology platform. This work showed the possibility to use GMMA particles as starting material for membrane components extraction, optimizing new and innovative platform, particularly for LPS or proteins recovery, in order to decrease the costs of goods (COGs). The present work is focused on the O: 4,5-antigen polysaccharide extraction (using the acid hydrolysis approach), purification and characterization from Salmonella Typhimurium SL1344 tolR- GMMA. NVGH, to over produce and collect GMMA, is developing new methods using over producing GMMA mutant strain (the tolR gene deletion results in substantial overproduction of outer membrane particles) and two consecutive TFF steps (Tangential Flow Filtration steps: micro-filtration at 0.2 μm and thereafter a second micro-filtration at 0.1 μm) at the end of the fermentation process to collect GMMA from bacterial suspensions. NVGH has developed another innovative platform for O-antigen extraction from biomass at the end of the fermentation process, using the acid hydrolysis approach of whole bacterial culture. The present work shows for the first time the possibility to use GMMA particles as O-antigens source (and in general as source of membrane components) due their membrane composition enriched in LPS. We have proven that, O-antigens can be extracted from GMMA using the direct acid hydrolysis method thus the consequent O-antigen purification process is easy and cost effective. This work provides the basis for the development of new vaccines, glyconiugate or proteins based, exploiting the same approach used and developed for S. Tyhphimurium SL1344 tolR- GMMA, which could be applied to other Gram negative strains.

Le malattie infettive causate dai microrganismi Gram-negativi rappresentano una tra le principali cause di mortalità a livello mondiale, specialmente nei paesi in via di sviluppo. L’attenzione di organizzazioni come UNICEF e WHO si è focalizzata sullo sviluppo di progetti volti a migliorare le aspettative di vita delle propalazioni nei paesi sottosviluppati, dove la scarsa disponibilità d’acqua potabile e le condizioni igienico-sanitarie precarie favoriscono il diffondersi di malattie diarroiche e respiratorie associate a microrganismi patogeni Gram-negativi. Una tra le soluzioni proposte per contenere e prevenire la diffusione di tali malattie è rappresentata dallo sviluppo di vaccini specifici contro i patogeni responsabili. I vaccini pensati, sviluppati e prodotti per i paesi in via di sviluppo devono però rispettare alcuni requisiti. Un aspetto importante è quello legato ai costi, i vaccini devono essere prodotti e immessi nel mercato a basso costo, per l'UNICEF e il GAVI, il prezzo per singola dose non deve superare la soglia di 1.00 euro. Un’altra caratteristica rilevante è legata alle proprietà del vaccino stesso, la preparazione finale deve rimanere stabile a temperatura ambiente e possibilmente garantire la protezione a largo spettro. Idealmente un vaccino per i paesi in via di sviluppo dovrebbe essere pensato e progettato in modo da essere facilmente manipolato e somministrato da personale non esperto, ad esempio evitando l’utilizzo di siringhe con ago. Novartis Vaccines Institute for Global Health (NVGH) mira a sviluppare un vaccino ad ampio spettro utilizzando una particolare caratteristica dei Gram negativi, ossia la capacità di originare e secernere vescicole dalla membrana esterna. Queste vescicole, chiamate Generalized Modules for Membrane Antigens (GMMA), note anche come “native outer membrane vesicles” (NOMV), sono naturalmente rilasciate dalla superficie dei batteri Gram-negativi rispecchiando quindi la composizione della membrana esterna, a differenza delle DOMV (detergent extracted outer membrane vesicles), ottenute da biomassa opportunamente trattata con specifici detergenti, le quali si presentano con struttura lipopolisaccaridica e lipoprtoieca diversa rispetto alla composizione della membrana esterna del batterio d’origine. Lo scopo di questo progetto di dottorato è stato quello di esaminare la possibilità di sviluppare vaccini a basso costo per i paesi in via di sviluppo, contro i microrganismi Gram-negativi utilizzando la piattaforma tecnologica GMMA. Questo lavoro ha dimostrato la possibilità di utilizzare le GMMA come materiale di partenza per l'estrazione di componenti di membrana, in particolare LPS o proteine. Il presente lavoro è focalizzato sull’estrazione, purificazione e caratterizzazione del polisaccaride O:4,5-antigen da GMMA secrete dal patogeno Salmonella Typhimurium SL1344 tolR-. Tale microrganismo geneticamente modificato (delezione del gene tolR) è stato utilizzato perché capace di sovra rilasciare GMMA durante il processo fermentativo, successivamente separate e recuperate dalla biomassa tramite due step consecutivi di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) utilizzando membrane a cut-off decrescenti, 0.2 μm per la prima TFF e 0.1 μm per la TFF successiva. Inoltre, NVGH ha sviluppato una piattaforma innovativa per l’estrazione del polisaccaride dalla membrana esterna dei Gram negativi utilizzando l'approccio dell’idrolisi acida direttamente su biomassa a fine fermentata, evitando così l’utilizzo del fenolo, considerato uno tra i metodi classici di estrazione di polisaccaridi da biomassa. Il presente lavoro mostra per la prima volta la possibilità di utilizzare le GMMA come fonte di estrazione dell’O-antigen per lo sviluppo di vaccini glico-coniugati e in generale come fonte di estrazione di componenti di membrana. Abbiamo dimostrato che, il polisaccaride O-antigen può essere estratto dalle GMMA applicando il metodo dell’idrolisi acida diretta e dimostrando come il conseguente processo di purificazione sia più facile e conveniente partendo dalle GMMA invece che dalla biomassa. Questo lavoro fornisce le basi per lo sviluppo di nuovi vaccini, proteici o gliconiugati, contro microrganismi patogeni Gram negativi, ai quali può essere applicata la stessa piattaforma sviluppata e ottimizzata per le GMMA prodotte da S. Tyhphimurium SL1344 tolR.