Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2739
Title: Affirmation of DNA barcoding as a poweful tool in cataloguing medicinal and aromatic plants in mediterranean forests
Other Titles: Studio del DNA barcoding come strumento per la catalogazione di piante aromatiche e medicinali nelle foreste mediterranee
Authors: Laiou, Angeliki
Keywords: DNA barcoding;Medicinal and aromatic plants;Mediterranean region;Piante medicinali e aromatiche;Mediterraneo;AGR/05
Issue Date: 27-May-2013
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
Abstract: 
From the pre-historic era, men have been using plants as medicine and in recent years,
medicinal and aromatic plants (MAPs) harvested from the wild still remain of immense importance.
MAPs are clearly an important global resource in terms of healthcare but they are also an important
economic resource. Consequently, MAPs are an ideal case for developing DNA barcodes. In this
doctorate thesis, more than 100 specimens were sampled in different biogeographic regions through
Italy and Greece (three provenances from Italy and one from Greece) of each country including also
some representatives from other countries for comparison. Thus, 38 medicinal and aromatic plant
species have been collected and being analyzed, derived from 22 genera, with a total number of 30
different provenances belonging to 17 families.
We used “core barcode” for land plants rbcL and matK, and tested trnH-psbA as additional
marker. Each marker was amplified with the universal primer pairs. RbcL displayed 100%
amplification success, followed by trnH-psbA 98%, while matK was unable to amplify some certain
plant groups (overall amplification success of 91).
Species discrimination success was attempted using sequence character states (Blastclust),
presence of barcoding-gap (uncorrected p-distances), species monophyly through inference of
RAxML dendrogram and assessment discrimination using GenBank. These approaches return
similar results in the discrimination level of species using all combined markers.
The trnH-psbA region showed the highest values of genetic variability; however this
divergence did not allow reliable alignment across all sequences and consequently contributed to
the absence of barcoding gap.
Regarding the results retrieved from Genbank submissions, the lowest percentage of
molecular data was retrieved surprisingly by MatK (37% of the species in GenBank), even if it is
considered one of the most recommended core-barcodes with the highest discriminatory power. The
majority of data were produced by trnH-psbA (65% of the species in GenBank) showed a good
coverage, highlighting that this marker, beyond the core barcode, is becoming the most widely used
plastid region.
On the whole, conserving medicinal and aromatic plants biodiversity should be given a
serious attention as well as the development of an integrated DNA database. An important
limitation DNA barcoding potential users may actually meet is related with a yet incomplete
reference list in the database as well as the common used similarity methods in these databases are
prone to errors. Moreover, the use of a fourth marker could be necessary to obtain adequate
discriminatory power. In conclusion, this doctorate thesis highlights the utility of DNA barcoding as
a promising tool in providing a practical and standardized identification of medicinal and aromatic
plants thus contributing to the conservation and the trade control of these valuable plant resources.

Sin dalla preistoria l’uomo ha usato le piante a scopo medicamentoso. Negli ultimi anni, le
piante medicinali aromatiche (PAM), raccolte in ambienti selvatici sono state riconosciute come
risorse molto importanti sia per la salvaguardia della biodiversità globale, sia per i possibili risvolti
per la salute umana, ed hanno assunto per questo un ruolo economico importante. Esse vengono
spesso commercializzate sotto forma di frammenti rendendo difficile o impossibile una
identificazione morfologica certa, e che lascia ampi spazi a possibili frodi commerciali. La tecnica
del DNA Barcoding si propone già da tempo come metodologia molecolare per la tracciabilità di
campioni biologici per i quali, per ragioni di vario tipo, sia impossibile il riconoscimento per via
morfologica. Per questo motivo i PAM costituiscono una applicazione ideale per la tecnica del
DNA barcoding, esse infatti potrebbero essere certificate in maniera univoca attraverso il loro DNA
anche in assenza di morfologia. Per questa tesi sono stati dunque analizzati più di 100 campioni
provenienti da varie zone biogeografiche, in particolare da tre provincie italiane ed una greca ed
includendo anche campioni da altri paesi per un miglior paragone.
Il dataset è costituito 38 specie, di 30 diverse provenienze, appartenenti a 22 generi diversi
per un totale di 17 famiglie. Ciascun campione è stato accuratamente conservato in erbario e
analizzato utilizzando i marcatori molecolari ufficiali del progetto Barcode per le piante (rbcL e
matK) e inoltre affiancando ad essi un terzo locus ( trnH-psbA ) segnalato in letteratura come molto
promettente.
I marcatori, amplificati con le coppie di primers universali del progetto Barcode, hanno
mostrato comportamenti diversi che hanno confermato i risultati ottenuti in studi analoghi, infatti
rbcL è stato amplificato e sequenziato con successo nel 100% dei casi, seguito da trnH-psbA con il
98% , e infine dal matK con solo il 91% di successo.
Diversi tipi di approcci sono stati utilizzati per la valutazione delle potenziali applicazioni
delle tecnica barcode alle PAM : i) la generazione degli aplotipi per evidenziare le sequenze
identiche in specie diverse, attraverso l’uso di Blastclust; ii) la presenza di barcoding-gap sia
utilizzando p-distance sia K2P; iii) la valutazione del successo di discriminazione con la verifica
della monofilia delle specie su dendrogramma; iv) test applicativo del dataset PAM all’interno del
database mondiale di sequenze nucleotidiche disponibile (GenBank) .
Tali approcci, pur evidenziando aspetti diversi legati alla metodica, mostrano risultati
concordi. La regione trnH-psbA, pur non essendo indicata tra i loci ufficiali del progetto barcode, ha
mostrato i valori migliori sia in termini di variabilità genetica sia come discriminazione delle specie
nel test applicativo su GenBank, mentre matK e rbcL mostrano livelli di successo decisamente
inferiori.
I risultati di questo studio sono, nel complesso, in linea con altri progetti Barcode ed
evidenziano come non sia ancora possibile una applicazione pratica e di routine di tale metodologia
in ambito vegetale. Infatti i problemi e i limiti che si sono evidenziati in questa tesi non sono
specifici del dataset di PAM analizzato, ma sono comuni a molti altri studi in ambito vegetale e
riguardano la scelta di marcatori molecolari più potenti in grado di discriminare specie molto vicine,
il potenziamento del database delle sequenze di riferimento e degli algoritmi di ricerca al suo
interno. Questi limiti consentono, attualmente, solo un utilizzo applicativo parziale della
metodologia Barcode, ma sottolineano la sua l’utilità come strumento in grado di contribuire alla
conservazione ed al controllo del commercio di risorse preziose quali le specie di piante
aromatiche e medicinali.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze e tecnologie per la gestione forestale e ambientale
URI: http://hdl.handle.net/2067/2739
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