Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2734
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dc.contributor.advisorPetruccioli, Maurizio-
dc.contributor.authorScargetta, Silvia-
dc.date.accessioned2015-12-01T12:31:49Z-
dc.date.available2015-12-01T12:31:49Z-
dc.date.issued2013-06-25-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2067/2734-
dc.descriptionDottorato di ricerca in Scienze ambientaliit
dc.description.abstractLa gestione degli scarti delle lavorazioni industriare e agrarie costituisce uno dei problemi legati allo sviluppo economico che ora più che mai mira a diventare sviluppo economico sostenibile. Per questo motivo, nel nostro Paese, secondo produttore di olio d’oliva, il compostaggio dei sottoprodotti derivanti dai frantoi oleari (OMW) rappresenta una forma di riciclaggio e valorizzazione di questi scarti. Tra i molteplici usi che questa tipologia di compost può consentire, un modo efficace ed economico risulta essere la sua applicazione in strategie di biorisanamento. Infatti, l’aggiunta di ammendanti organici a matrici contaminate può facilitare la degradazione dei contaminanti presenti. In questo contesto, il compost rappresenta sia una fonte di nutrimento, che può stimolare l’attività degradativa del microbiota autoctono, sia rappresentare una fonte di biomassa microbica con grandi potenzialità degradative che può essere integrata alla matrice contaminata. Nel compostaggio, come anche nel biorisanamento, i microrganismi rappresentano la chiave di volta che garantisce la riuscita o meno del processo. E’ chiaro quindi come studi di ecologia microbica possano aiutare a comprendere i meccanismi che sono alla base di questi processi, fornendo gli strumenti adeguati per intervenire e ottimizzare i processi stessi al fine di conseguire il successo della strategia applicata. In quest’ottica, questo lavoro di tesi ha come obiettivo quello di approfondire le conoscenze legate agli aspetti di ecologia microbica del processo di valorizzazione degli OMW con particolare attenzione all’applicazione in strategie di biorisanamento. L’approccio sperimentale utilizzato per gli studi di ecologia microbica nei vari esperimenti, ha coinvolto sia metodi coltura-dipendenti, sia coltura-indipendenti. I metodi colturadipendenti che prevedevano la coltivazione di funghi e batteri in terreni appropriati, erano finalizzati alla conta vitale e alla valutazione delle attività enzimatiche. I ceppi di particolare interesse erano poi isolati e successivamente identificati mediante il sequenziamento dei loro geni ribosomali (rRNA). Queste tecniche venivano integrate con metodi indipendenti dalla coltivazione quali quelli molecolari basati sul DNA metagenomico. Questo tipo di approccio è stato applicato per lo studio della biodiversità e delle dinamiche delle comunità microbiche attraverso l’elettroforesi su gel a gradiente denaturante (DGGE) del frammento del gene ribosomale (18S per i funghi e 16S per i batteri) che forniva dei fingerprinting di comunità; l’analisi numerica dei profili ottenuti permetteva di valutare sia la similarità delle varie comunità e di seguire l’evoluzione di una comunità del tempo, sia ottenere per ciascun profilo gli indici ecologici. La valutazione dell’abbondanza delle varie comunità microbiche era ottenuta grazie all’uso della PCR quantitativa (qPCR). La prima parte del lavoro di tesi ha riguardato lo studio del processo di compostaggio di scarti proveniente da frantoi a due fasi, realizzato in collaborazione con l'Istituto per i Sistemi Agricoli e forestali del Mediterraneo (CNR, Perugia). Il processo è stato monitorato per 140 giorni durante i quali venivano periodicamente raccolti dei campioni per la valutazione della trasformazione della materia organica e per lo studio delle popolazioni microbiche coinvolte in questo processo. I parametri chimici mostravano il tipico trend del compostaggio in cui la temperatura mostrava una fase di attivazione iniziale, seguita da una fase termofila, risultato di un’intensa attività microbica e una fase finale mesofila durante la quale la temperatura diminuiva e rimaneva stabile fino alla fine del processo. Inoltre, si assisteva a un’alta mineralizzazione e umificazione della sostanza organica, associata a un’alcalinizzazione della matrice, nonché ad un abbattimento dei polifenoli ottenendo così la trasformazione di questo scarto in un ammendante di buona qualità. Le analisi microbiologiche effettuate sia per la valutazione della biodiversità che dell’abbondanza, mostravano come molte popolazioni batteriche e fungine, erano dominanti e venivano osservate solo in fasi specifiche, indicando la presenza di microrganismi specializzati e con ruoli diversi durante la biotrasformazione di questo scarto. In particolare, la fase termofila, in cui si registrava la più alta attività degradativa, era caratterizzata da una più alta biodiversità, mentre in corrispondenza dalla stabilizzazione chimica del processo, le comunità erano caratterizzate da una biodiversità più bassa e la struttura tendeva a stabilizzarsi. Era interessante notare come la maggior parte dei batteri tannasi-positivi erano stati isolati durante la fase termofila, suggerendo quindi un ruolo fondamentale di queste popolazioni nella trasformazione della materia organica. L’identificazione delle popolazioni fungine durante il processo evidenziava come anche questi, abbiano un ruolo strategico in questo processo, in particolare durante la fase termofila erano presenti specie termofile e termotolleranti molte delle quali già note per la capacità di degradare sostanze complesse quali lignina o cellulosa. Come diretta conseguenza dello studio delle popolazioni microbiche coinvolte nel compostaggio degli OMW, venivano anche analizzate le comunità batteriche di differenti compost ottenuti dallo stesso tipo di sottoprodotto ma prodotti variando alcuni parametri tecnologici. Lo scopo di questo studio, era quello di cercare una possibile relazione tra la diversità microbica, le tecnologie di compostaggio e le caratteristiche chimiche del compost prodotto. L’analisi DGGE dei 15 compost ha mostrato una grande variabilità dei fingerprinting delle comunità batteriche. Interessante era notare come la diversità batterica sembrava negativamente correlata con il pH ma positivamente con il rapporto C/N, principalmente a causa di una correlazione negativa con l’azoto totale. L’analisi statistica avanzata della coinerzia ha evidenziato come la diversità dei vari compost sia lega al processo di maturazione. Infatti, i compost caratterizzati da una bassa complessità della struttura della comunità batterica indicavano una stabilizzazione del processo e quindi una maturazione della matrice compostata caratterizzata da valori di pH, azoto e rapporto C/N tipici di un compost maturo. Quest’analisi, conferma e rafforza i risultati ottenuti durante il monitoraggio del processo di compostaggio nel quale la biodiversità microbica era strettamente legata al livello di maturazione raggiunto dalla matrice. Nel loro insieme queste indicazioni hanno suggerito l’utilizzo di un possibile indice aggiuntivo per la valutazione della maturità del compost basata sulla diversità batterica. La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata alla valutazione degli effetti del compost sul microbiota indigeno di ambienti contaminati, con particolare attenzione al destino delle comunità microbiche del compost. Con quest’obiettivo, il compost OMW caratterizzato nella prima parte della tesi, nominato TPOMW, è stato utilizzato per realizzare due studi di biorisanamento su scala di laboratorio che coinvolgono un terreno storicamente contaminato con diesel-oil e un fango contaminato da farmaci. Nella prima prova, il suolo storicamente contaminato da diesel-oil veniva ammendato con il compost TPOMW e due spent mushroom compost (SMC) derivanti dalla coltivazione di Agaricus bisporus e Pleorotus ostreatus, e incubati per 120 giorni. I campioni sono stati prelevati per le analisi a intervalli regolari. Gli effetti del compost TPOMW erano confrontati con quelli di SMC. Per studiare gli effetti ecologici di questa strategia di bonifica sulle comunità microbiche indigene, tutti i compost sono stati utilizzati sia sterilizzati che non, con l'obiettivo di simulare rispettivamente una strategia di biostimulation (nutrienti presenti nel compost) e bioaugmentation (biomasse di compost). I risultati ottenuti dall'analisi DGGE indicavano che l’aggiunta dei compost al suolo contaminato ne modificavano profondamente le comunità batteriche e fungine che mostravano dei fingerprinting estremamente complessi e stabili durante tutto il periodo di incubazione. Al contrario, quando il terreno veniva ammendato con i compost sterilizzati i fingerprinting microbici mostravano un’evoluzione dalle comunità che passavano da una struttura molto semplice (tipica di suoli contaminati) ad una complessa, ricca di biodiversità. La quantificazione delle popolazioni batteriche e fungine, mediante qPCR, confermavano che i compost utilizzati fornivano al suolo una biomassa microbica molto ricca, mentre i compost sterilizzati erano in grado di stimolare la crescita di popolazioni microbiche autoctone. Complessivamente questi dati suggerivano che l’aggiunta di compost, anche di tipologie molto diverse tra loro (OMW compost e Smc), potrebbe essere considerata come una strategia di bioaugmentation, dove le comunità esogene molto complesse sono state in grado di vincere la competizione con la microflora endogena del suolo colonizzando completamente la matrice contaminata. Al contrario, una strategia di biostimulation, simulata con l’utilizzo dei compost sterilizzati, sembrava stimolare la crescita della flora microbica endogena che, teoricamente, potrebbe essere la più adatta alla degradazione dei contaminanti. Anche se i dati relativi rimozione dei contaminanti chimici sono, al momento, non disponibili, si può ipotizzare che l'aggiunta di compost ai terreni contaminati può non essere adatta per una strategia di biorisanamento, poiché le complesse comunità microbiche del compost tendono ad inibire le popolazioni microbiche endogene potenzialmente attive. La seconda prova di biorisanamento su scala di laboratorio veniva effettuata su fanghi, derivanti da un impianto di depurazione, contaminati da farmaci. Per monitorare meglio la capacità degli ammendanti di stimolare il risanamento, il fango veniva arricchito con concentrazioni note di carbamazepina, un farmaco antiepilettico altamente persistente e comunemente presente in questa tipologia di matrice. Per studiare gli effetti microbiologici sul microbiota indigeno durante il biorisanamento di questi fanghi contaminati ad hoc, sono stati utilizzati due diversi tipi di compost derivati da OMW dei frantoi che utilizzano il processo a due fasi: compost TPOMW ottenuto dal processo di compostaggio normale (e già utilizzato nella prima prova di bioremediation) e un compost, denominato "compost big bag", prodotto con un procedimento innovativo che consiste in una stabilizzazione dello scarto mediante un processo di compostaggio statico. Come nella prima prova, i compost venivano utilizzati non sterilizzati e sterilizzati per capire se gli effetti di biorisanamento potevano essere dovuti alle sostanze nutritive o alle comunità microbiche aggiunte con gli ammendanti. Durante la sperimentazione durata 30 giorni, le dinamiche delle comunità microbiche sono state monitorate tramite le analisi DGGE e qPCR. L’applicazione dei compost tal quali in una matrice contaminata, sembrava non produrre risultati soddisfacenti, in quanto le comunità dei compost tendevano a colonizzare il substrato, inibendo la microflora endogena potenzialmente in grado di degradare il contaminante. Al contrario, l’apporto di nutrienti, forniti con compost sterile, sembrava stimolare adeguatamente le popolazioni indigene favorendo l’espressione delle loro potenzialità degradative, con conseguente rimozione anche solo parziale, del contaminante in tempi relativamente più brevi rispetto ad una attenuazione naturale. Per quanto riguarda le comunità fungine, mentre nel controllo e nei trattamenti in cui erano usati i compost sterilizzati non veniva rilevata la presenza di alcuna popolazione, se non quelle imputabili ad una colonizzazione successive di microrganismi ambientali, nei fanghi trattati con i compost non sterilizzati la comunità fungina subiva un brusco calo della biodiversità probabilmente dovuta alle alte concentrazioni del farmaco. Dati questi risultati, e confrontati con quelli delle comunità batteriche, si può supporre che le comunità fungine non abbiano avuto una forte rilevanza sull’attività di degradazione del farmaco. Questo lavoro di tesi ha fornito una buona dimostrazione di come gli studi di ecologia microbica siano in grado di supportare l'ottimizzazione della valorizzazione degli scarti agro-industriali e le definizioni di strategie ottimali di biorisanamento. In particolare, è stato dimostrato come, durante il processo di compostaggio di OMW, una rapida successione di diverse popolazioni microbiche specializzate sia responsabile della biotrasformazione della sostanza organica con conseguente produzione di un compost di buona qualità. E' stato anche dimostrato che si deve prestare massima attenzione nella scelta della strategia da adottare in interventi di biorisanamento che prevedono l’uso di questa tipologia di compost. La ricca e complessa comunità microbica che caratterizza questa matrice può, infatti, inibire il potenziale degradativo delle popolazioni endogene, mentre le strategie di biostimaltion, basate sull’aggiunta di nutrienti, possono rappresentare un approccio di successo.it
dc.description.abstractThe management of agro-industrial waste is one of the problems related to economic development that now more than ever must become a sustainable economic development. For this reason in our country, second producer of olive oil, the composting of olive mill waste (OMW) represents a form of valorisation of this waste. Among the many uses of this kind of compost, one that may be valuable and economically convenient is its application in bioremediation strategies. Indeed, the application of organic amendments in bioremediation can facilitate the degradation of organic pollutants present in soil. In particular, compost may represent a source of nutrients, which can stimulate the degradative activity of the indigenous microbiota, and a source of an exogenous microbial population with great metabolic potential that can be integrated in the polluted soil. In composting, as well as in bioremediation, microorganisms are the key to ensuring the success or failure of the process. It is therefore clear that microbial ecology studies can help to understand the mechanisms that underlie these processes, providing the tools to intervene and optimize the strategy applied. The main aim of the thesis project was to deepen our understanding of microbial ecology aspects of the valorisation of OMW with a particular regard to the application in bioremediation strategies. The experimental approach used for microbial ecology studies in the different experiments involved both culture-dependent and culture-independent methods. The culture-dependent methods, which were based on the cultivation of fungi and bacteria in appropriate media, were used for viable count and evaluation of enzymatic activities. Microbial isolates of particular interest were also identified by sequencing their ribosomal genes (rRNA). These techniques were integrated with cultivation-independent approach such as molecular techniques, based on metagenomic DNA. In particular, these were used to study the biodiversity of bacterial and fungal community using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analyses of rRNA gene fragments (16S for bacteria and 18S rRNA for fungi) that provided the fingerprinting of communities. Numerical analysis of the DGGE fingerprints provided an immediate comparison of the community similarity and allowed the computation of ecological indexes. The abundance of bacterial and fungal populations was evaluated with qPCR analyses of rRNA genes. The first part of the thesis work has focused on the study of the composting process of humid husk from a two-phase olive mill (TPOMW) and has been carried out in collaboration with the Institute for Agriculture and Forest Systems in the Mediterranean (CNR, Perugia). The composting process was monitored for 140 days and in this period samples at different stages were collected to evaluate the organic matter transformation and to study the microbial populations involved in this process. The chemical parameters showed the typical trend of composting, in which temperature showed an initial activation phase, followed by a thermophilic phase, result of an intense microbial activity, and a final mesophilic phase during which the temperature decreased and remained stable until the end of the process. During the composting process high mineralization and humification of carbon, loss of nitrogen and complete degradation of polyphenols led to the waste biotransformation into a high-quality compost. Microbiological analyses, carried out for the assessment of microbial biodiversity and abundance, showed that many bacterial and fungal populations were dominant and were observed only in specific phases, indicating the presence of specialized microorganisms with different roles during the biotransformation of this waste. In particular, the thermophilic phase, in which the highest degrading activity was recorded, was characterized by the highest biodiversity, while in correspondence of the chemical stabilization of the process, the communities were characterized by a lower biodiversity with the community structure that tended to stabilize. It’s interesting to note that most of the tannin-degrading bacteria were isolated during the thermophilic phase, suggesting a pivotal role for these populations in the of organic matter transformation. The identification of fungal populations during the process showed their strategic role in the process, particularly during the thermophilic phase where thermotolerant and thermophilic species were found. Interestingly, many of these species are already known for their ability to degrade complex substances such as lignin or cellulose. As a direct consequence of the study about microbial populations involved in the composting of OMW, bacterial communities of different compost obtained from the same type of product varying the technological parameters, were also analysed. The aim of this study was to explore the possible relationship between microbial diversity, composting technologies and chemical features of the compost produced. The DGGE analysis of the 15 composts showed a great variability of the fingerprinting of bacterial communities. Interestingly, bacterial diversity seemed negatively correlated with the pH but positively with the C/N ratio, mainly due to a negative correlation with total nitrogen. Co-inertia analysis of the co inertia showed that the diversity of compost binds to the maturation process. Indeed, compost with a low complexity of bacterial community indicated a stabilization of the process, and a maturation of the composted matrix characterized by values of pH, nitrogen and C/N ratio of a typical mature compost. This analysis confirms and strengthens the results obtained during the monitoring of the composting process in which microbial biodiversity was closely linked to the level of maturity of the matrix. Taken together these indications suggest the use of a possible additional index for the assessment of the maturity of the compost based on bacterial diversity. The second part of the thesis work was aimed to evaluating the effects of compost addition on the indigenous microbiota of contaminated environments, with particular attention to the fate of the compost microbial communities. With this aim, the TPOMW compost characterized during the first part of the thesis was used, together with other kind of composts, to implement two lab-scale bioremediation trials involving a soil historically contaminated with diesel oil and a drug-spiked sludge. In the first bioremediation trial, the diesel oil contaminated soil was amended with the TPOMW compost and two spent mushroom composts (SMC A and SMC P) from the cultivation of Agaricus bisporus and Pleorotus ostreatus, and incubated for 120 days. Samples were taken for analyses at regular intervals. The effects of the TPOMW compost were compared to those of SMC. To study the ecological effects of this remediation strategy on the indigenous microbial communities, all the composts were used both sterilized and unsterilized, with the aim of simulating biostimulation (nutrients presents in composts) and bioaugmentation (biomass of composts), respectively. The DGGE analysis indicated that adding the compost to the contaminated soil dramatically changed the bacterial and fungal communities that showed complex and stable fingerprints during all the incubation period. On the contrary, when the soil was amended with the sterilized composts the microbial fingerprints showed an evolution from a very simple community (typical of contaminated soils) to a complex community, rich in biodiversity. qPCR quantification of bacterial and fungal populations confirmed that the composts provided to the soil a very rich biomass, while the sterilized composts were able to stimulate the growth of microbial populations. Taken together, these data suggested that the amendment with composts, even of very different kind (namely TPOMW compost and SMC), could be regarded as a bioaugmentation strategy where very complex exogenous communities were able to win the competition with the endogenous soil microbiota and completely colonize the contaminated soil. On the contrary, the biostimulation approach, simulated by the addition of sterilized composts, seemed to stimulate the growth of the endogenous microbiota that, theoretically, might be the more suitable to achieve the degradation of the contaminants. Even if chemical data regarding contaminant removal are, at the moment, not available, it is possible to draw the hypothesis that the addition of compost to contaminated soil may not be a suitable strategy for bioremediation as the complex biomass present in this kind of amendment tend to inhibit the potentially active microbial populations. The second lab-scale bioremediation trail was based on a sewage sludge contaminated with several drug residues. To better monitor the capacity of the amendments to stimulate remediation, the sludge was spiked with known concentrations of carbamazepine, a highly persistent antiepileptic drug commonly found in this kind of matrix. To investigate the microbiological effects on indigenous microbiota during the bioremediation of the spiked sludge, two different kinds of composts derived of OMW were used: TPOMW compost obtained from normal composting process (and already used in the first bioremediation trial) and a OMW compost, named “big bag compost” produced with an innovative procedure involving a stabilization of the waste and a static composting process. As in the first trial, the composts were used non-sterilized and sterilized to understand if the putative bioremediation effects were due to either the nutrients or the microbial communities added with the amendments. During the 30 days of trial the microbial communities dynamics were monitored by the DGGE and qPCR, and together with carbamazepine concentrations. The use of compost in a contaminated matrix, did not seem to produce satisfactory results, because the community of compost tended to colonize the substrate, inhibiting the endogenous microflora that can, potentially, degrade the contaminant. On the contrary, the supply of nutrients, which are supplied with sterile compost, it seemed to adequately stimulate indigenous populations by promoting the expression of their degradative potential, resulting in the removal, even partial, of the contaminant in a relatively shorter compared to a natural attenuation. As regards fungal communities, while in the control and in the treatments in which sterilized composts were used was not detected the presence of any fungal population, if not those attributable to a subsequent colonization of environment microorganisms, in the sludge treated with the non-sterilized compost, fungal community suffered a sharp decline of biodiversity probably due to the high concentrations of the drug. Given these results, and compared with those of bacterial communities, we can assume that the fungal communities did not have a strong importance on the activity of degradation of the drug. This Ph.D. thesis work provided a good demonstration of how microbial ecology studies can support the optimization of agro-industrial waste valorisation and the definitions of optimal bioremediation strategies. In particular, it was demonstrated how during the composting process of OMW, a rapid succession of several specialized microbial populations drives the organic matter biotransformation that ensures the physico-chemical changes related to the production of a good quality amendment. It was also shown that great care should be taken when planning the application of this kind of composts in the bioremediation of contaminated environments. The rich and complex microbiota that characterizes these amendments may, in fact, inhibit the degradative potential of endogenous populations, while biostimulation strategies based on the addition of nutrients may represent a successful remediation approach.en
dc.language.isoitit
dc.publisherUniversità degli studi della Tuscia - Viterboit
dc.relation.ispartofseriesTesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo-
dc.subjectCompostaggioit
dc.subjectValorizzazione scartiit
dc.subjectBioremediationit
dc.subjectDGGEit
dc.subjectqPCRit
dc.subjectCompostingen
dc.subjectWaste valorizationen
dc.subjectBIO/19it
dc.titleAspetti di ecologia microbica della valorizzazione degli scarti dei frantoi oleari: dinamiche delle comunità microbiche durante il processo di compostaggio e applicazione in strategie di biorisanamentoit
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.rights.accessRightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessen
item.fulltextWith Fulltext-
item.openairetypeDoctoral Thesis-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1it-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
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