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Title: Aspetti di ecologia microbica della valorizzazione degli scarti dei frantoi oleari: dinamiche delle comunità microbiche durante il processo di compostaggio e applicazione in strategie di biorisanamento
Authors: Scargetta, Silvia
Keywords: Compostaggio;Valorizzazione scarti;Bioremediation;DGGE;qPCR;Composting;Waste valorization;BIO/19
Issue Date: 25-Jun-2013
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
Abstract: 
La gestione degli scarti delle lavorazioni industriare e agrarie costituisce uno dei problemi
legati allo sviluppo economico che ora più che mai mira a diventare sviluppo economico
sostenibile. Per questo motivo, nel nostro Paese, secondo produttore di olio d’oliva, il
compostaggio dei sottoprodotti derivanti dai frantoi oleari (OMW) rappresenta una forma
di riciclaggio e valorizzazione di questi scarti. Tra i molteplici usi che questa tipologia di
compost può consentire, un modo efficace ed economico risulta essere la sua applicazione
in strategie di biorisanamento. Infatti, l’aggiunta di ammendanti organici a matrici
contaminate può facilitare la degradazione dei contaminanti presenti. In questo contesto, il
compost rappresenta sia una fonte di nutrimento, che può stimolare l’attività degradativa
del microbiota autoctono, sia rappresentare una fonte di biomassa microbica con grandi
potenzialità degradative che può essere integrata alla matrice contaminata. Nel
compostaggio, come anche nel biorisanamento, i microrganismi rappresentano la chiave di
volta che garantisce la riuscita o meno del processo. E’ chiaro quindi come studi di
ecologia microbica possano aiutare a comprendere i meccanismi che sono alla base di
questi processi, fornendo gli strumenti adeguati per intervenire e ottimizzare i processi
stessi al fine di conseguire il successo della strategia applicata.
In quest’ottica, questo lavoro di tesi ha come obiettivo quello di approfondire le
conoscenze legate agli aspetti di ecologia microbica del processo di valorizzazione degli
OMW con particolare attenzione all’applicazione in strategie di biorisanamento.
L’approccio sperimentale utilizzato per gli studi di ecologia microbica nei vari esperimenti,
ha coinvolto sia metodi coltura-dipendenti, sia coltura-indipendenti. I metodi colturadipendenti
che prevedevano la coltivazione di funghi e batteri in terreni appropriati, erano
finalizzati alla conta vitale e alla valutazione delle attività enzimatiche. I ceppi di
particolare interesse erano poi isolati e successivamente identificati mediante il
sequenziamento dei loro geni ribosomali (rRNA). Queste tecniche venivano integrate con
metodi indipendenti dalla coltivazione quali quelli molecolari basati sul DNA
metagenomico. Questo tipo di approccio è stato applicato per lo studio della biodiversità e
delle dinamiche delle comunità microbiche attraverso l’elettroforesi su gel a gradiente
denaturante (DGGE) del frammento del gene ribosomale (18S per i funghi e 16S per i
batteri) che forniva dei fingerprinting di comunità; l’analisi numerica dei profili ottenuti
permetteva di valutare sia la similarità delle varie comunità e di seguire l’evoluzione di una
comunità del tempo, sia ottenere per ciascun profilo gli indici ecologici. La valutazione
dell’abbondanza delle varie comunità microbiche era ottenuta grazie all’uso della PCR
quantitativa (qPCR).
La prima parte del lavoro di tesi ha riguardato lo studio del processo di compostaggio di
scarti proveniente da frantoi a due fasi, realizzato in collaborazione con l'Istituto per i
Sistemi Agricoli e forestali del Mediterraneo (CNR, Perugia). Il processo è stato
monitorato per 140 giorni durante i quali venivano periodicamente raccolti dei campioni
per la valutazione della trasformazione della materia organica e per lo studio delle
popolazioni microbiche coinvolte in questo processo. I parametri chimici mostravano il
tipico trend del compostaggio in cui la temperatura mostrava una fase di attivazione
iniziale, seguita da una fase termofila, risultato di un’intensa attività microbica e una fase
finale mesofila durante la quale la temperatura diminuiva e rimaneva stabile fino alla fine
del processo. Inoltre, si assisteva a un’alta mineralizzazione e umificazione della sostanza
organica, associata a un’alcalinizzazione della matrice, nonché ad un abbattimento dei
polifenoli ottenendo così la trasformazione di questo scarto in un ammendante di buona
qualità. Le analisi microbiologiche effettuate sia per la valutazione della biodiversità che
dell’abbondanza, mostravano come molte popolazioni batteriche e fungine, erano
dominanti e venivano osservate solo in fasi specifiche, indicando la presenza di
microrganismi specializzati e con ruoli diversi durante la biotrasformazione di questo
scarto. In particolare, la fase termofila, in cui si registrava la più alta attività degradativa,
era caratterizzata da una più alta biodiversità, mentre in corrispondenza dalla
stabilizzazione chimica del processo, le comunità erano caratterizzate da una biodiversità
più bassa e la struttura tendeva a stabilizzarsi. Era interessante notare come la maggior
parte dei batteri tannasi-positivi erano stati isolati durante la fase termofila, suggerendo
quindi un ruolo fondamentale di queste popolazioni nella trasformazione della materia
organica. L’identificazione delle popolazioni fungine durante il processo evidenziava come
anche questi, abbiano un ruolo strategico in questo processo, in particolare durante la fase
termofila erano presenti specie termofile e termotolleranti molte delle quali già note per la
capacità di degradare sostanze complesse quali lignina o cellulosa.
Come diretta conseguenza dello studio delle popolazioni microbiche coinvolte nel
compostaggio degli OMW, venivano anche analizzate le comunità batteriche di differenti
compost ottenuti dallo stesso tipo di sottoprodotto ma prodotti variando alcuni parametri
tecnologici. Lo scopo di questo studio, era quello di cercare una possibile relazione tra la
diversità microbica, le tecnologie di compostaggio e le caratteristiche chimiche del
compost prodotto. L’analisi DGGE dei 15 compost ha mostrato una grande variabilità dei
fingerprinting delle comunità batteriche. Interessante era notare come la diversità batterica
sembrava negativamente correlata con il pH ma positivamente con il rapporto C/N,
principalmente a causa di una correlazione negativa con l’azoto totale. L’analisi statistica
avanzata della coinerzia ha evidenziato come la diversità dei vari compost sia lega al
processo di maturazione. Infatti, i compost caratterizzati da una bassa complessità della
struttura della comunità batterica indicavano una stabilizzazione del processo e quindi una
maturazione della matrice compostata caratterizzata da valori di pH, azoto e rapporto C/N
tipici di un compost maturo. Quest’analisi, conferma e rafforza i risultati ottenuti durante il
monitoraggio del processo di compostaggio nel quale la biodiversità microbica era
strettamente legata al livello di maturazione raggiunto dalla matrice. Nel loro insieme
queste indicazioni hanno suggerito l’utilizzo di un possibile indice aggiuntivo per la
valutazione della maturità del compost basata sulla diversità batterica.
La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata alla valutazione degli effetti del
compost sul microbiota indigeno di ambienti contaminati, con particolare attenzione al
destino delle comunità microbiche del compost. Con quest’obiettivo, il compost OMW
caratterizzato nella prima parte della tesi, nominato TPOMW, è stato utilizzato per
realizzare due studi di biorisanamento su scala di laboratorio che coinvolgono un terreno
storicamente contaminato con diesel-oil e un fango contaminato da farmaci.
Nella prima prova, il suolo storicamente contaminato da diesel-oil veniva ammendato con
il compost TPOMW e due spent mushroom compost (SMC) derivanti dalla coltivazione di
Agaricus bisporus e Pleorotus ostreatus, e incubati per 120 giorni. I campioni sono stati
prelevati per le analisi a intervalli regolari. Gli effetti del compost TPOMW erano
confrontati con quelli di SMC. Per studiare gli effetti ecologici di questa strategia di
bonifica sulle comunità microbiche indigene, tutti i compost sono stati utilizzati sia
sterilizzati che non, con l'obiettivo di simulare rispettivamente una strategia di
biostimulation (nutrienti presenti nel compost) e bioaugmentation (biomasse di compost).
I risultati ottenuti dall'analisi DGGE indicavano che l’aggiunta dei compost al suolo
contaminato ne modificavano profondamente le comunità batteriche e fungine che
mostravano dei fingerprinting estremamente complessi e stabili durante tutto il periodo di
incubazione. Al contrario, quando il terreno veniva ammendato con i compost sterilizzati i
fingerprinting microbici mostravano un’evoluzione dalle comunità che passavano da una
struttura molto semplice (tipica di suoli contaminati) ad una complessa, ricca di
biodiversità. La quantificazione delle popolazioni batteriche e fungine, mediante qPCR,
confermavano che i compost utilizzati fornivano al suolo una biomassa microbica molto
ricca, mentre i compost sterilizzati erano in grado di stimolare la crescita di popolazioni
microbiche autoctone. Complessivamente questi dati suggerivano che l’aggiunta di
compost, anche di tipologie molto diverse tra loro (OMW compost e Smc), potrebbe essere
considerata come una strategia di bioaugmentation, dove le comunità esogene molto
complesse sono state in grado di vincere la competizione con la microflora endogena del
suolo colonizzando completamente la matrice contaminata. Al contrario, una strategia di
biostimulation, simulata con l’utilizzo dei compost sterilizzati, sembrava stimolare la
crescita della flora microbica endogena che, teoricamente, potrebbe essere la più adatta alla
degradazione dei contaminanti. Anche se i dati relativi rimozione dei contaminanti chimici
sono, al momento, non disponibili, si può ipotizzare che l'aggiunta di compost ai terreni
contaminati può non essere adatta per una strategia di biorisanamento, poiché le complesse
comunità microbiche del compost tendono ad inibire le popolazioni microbiche endogene
potenzialmente attive.
La seconda prova di biorisanamento su scala di laboratorio veniva effettuata su fanghi,
derivanti da un impianto di depurazione, contaminati da farmaci. Per monitorare meglio la
capacità degli ammendanti di stimolare il risanamento, il fango veniva arricchito con
concentrazioni note di carbamazepina, un farmaco antiepilettico altamente persistente e
comunemente presente in questa tipologia di matrice. Per studiare gli effetti microbiologici
sul microbiota indigeno durante il biorisanamento di questi fanghi contaminati ad hoc,
sono stati utilizzati due diversi tipi di compost derivati da OMW dei frantoi che utilizzano
il processo a due fasi: compost TPOMW ottenuto dal processo di compostaggio normale (e
già utilizzato nella prima prova di bioremediation) e un compost, denominato "compost big
bag", prodotto con un procedimento innovativo che consiste in una stabilizzazione dello
scarto mediante un processo di compostaggio statico. Come nella prima prova, i compost
venivano utilizzati non sterilizzati e sterilizzati per capire se gli effetti di biorisanamento
potevano essere dovuti alle sostanze nutritive o alle comunità microbiche aggiunte con gli
ammendanti. Durante la sperimentazione durata 30 giorni, le dinamiche delle comunità
microbiche sono state monitorate tramite le analisi DGGE e qPCR. L’applicazione dei
compost tal quali in una matrice contaminata, sembrava non produrre risultati
soddisfacenti, in quanto le comunità dei compost tendevano a colonizzare il substrato,
inibendo la microflora endogena potenzialmente in grado di degradare il contaminante. Al
contrario, l’apporto di nutrienti, forniti con compost sterile, sembrava stimolare
adeguatamente le popolazioni indigene favorendo l’espressione delle loro potenzialità
degradative, con conseguente rimozione anche solo parziale, del contaminante in tempi
relativamente più brevi rispetto ad una attenuazione naturale. Per quanto riguarda le
comunità fungine, mentre nel controllo e nei trattamenti in cui erano usati i compost
sterilizzati non veniva rilevata la presenza di alcuna popolazione, se non quelle imputabili
ad una colonizzazione successive di microrganismi ambientali, nei fanghi trattati con i
compost non sterilizzati la comunità fungina subiva un brusco calo della biodiversità
probabilmente dovuta alle alte concentrazioni del farmaco. Dati questi risultati, e
confrontati con quelli delle comunità batteriche, si può supporre che le comunità fungine
non abbiano avuto una forte rilevanza sull’attività di degradazione del farmaco.
Questo lavoro di tesi ha fornito una buona dimostrazione di come gli studi di ecologia
microbica siano in grado di supportare l'ottimizzazione della valorizzazione degli scarti
agro-industriali e le definizioni di strategie ottimali di biorisanamento. In particolare, è
stato dimostrato come, durante il processo di compostaggio di OMW, una rapida
successione di diverse popolazioni microbiche specializzate sia responsabile della
biotrasformazione della sostanza organica con conseguente produzione di un compost di
buona qualità. E' stato anche dimostrato che si deve prestare massima attenzione nella
scelta della strategia da adottare in interventi di biorisanamento che prevedono l’uso di
questa tipologia di compost. La ricca e complessa comunità microbica che caratterizza
questa matrice può, infatti, inibire il potenziale degradativo delle popolazioni endogene,
mentre le strategie di biostimaltion, basate sull’aggiunta di nutrienti, possono rappresentare
un approccio di successo.

The management of agro-industrial waste is one of the problems related to economic
development that now more than ever must become a sustainable economic development.
For this reason in our country, second producer of olive oil, the composting of olive mill
waste (OMW) represents a form of valorisation of this waste.
Among the many uses of this
kind of compost, one that may be valuable and economically convenient is its application
in bioremediation strategies. Indeed, the application of organic amendments in
bioremediation can facilitate the degradation of organic pollutants present in soil. In
particular, compost may represent a source of nutrients, which can stimulate the
degradative activity of the indigenous microbiota, and a source of an exogenous microbial
population with great metabolic potential that can be integrated in the polluted soil. In
composting, as well as in bioremediation, microorganisms are the key to ensuring the
success or failure of the process. It is therefore clear that microbial ecology studies can
help to understand the mechanisms that underlie these processes, providing the tools to
intervene and optimize the strategy applied.
The main aim of the thesis project was to deepen our understanding of microbial ecology
aspects of the valorisation of OMW with a particular regard to the application in
bioremediation strategies.
The experimental approach used for microbial ecology studies in the different experiments
involved both culture-dependent and culture-independent methods. The culture-dependent
methods, which were based on the cultivation of fungi and bacteria in appropriate media,
were used for viable count and evaluation of enzymatic activities. Microbial isolates of
particular interest were also identified by sequencing their ribosomal genes (rRNA). These
techniques were integrated with cultivation-independent approach such as molecular
techniques, based on metagenomic DNA. In particular, these were used to study the
biodiversity of bacterial and fungal community using denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) analyses of rRNA gene fragments (16S for bacteria and 18S
rRNA for fungi) that provided the fingerprinting of communities. Numerical analysis of
the DGGE fingerprints provided an immediate comparison of the community similarity
and allowed the computation of ecological indexes. The abundance of bacterial and fungal
populations was evaluated with qPCR analyses of rRNA genes.
The first part of the thesis work has focused on the study of the composting process of
humid husk from a two-phase olive mill (TPOMW) and has been carried out in
collaboration with the Institute for Agriculture and Forest Systems in the Mediterranean
(CNR, Perugia). The composting process was monitored for 140 days and in this period
samples at different stages were collected to evaluate the organic matter transformation
and to study the microbial populations involved in this process. The chemical parameters
showed the typical trend of composting, in which temperature showed an initial activation
phase, followed by a thermophilic phase, result of an intense microbial activity, and a final
mesophilic phase during which the temperature decreased and remained stable until the
end of the process. During the composting process high mineralization and humification of
carbon, loss of nitrogen and complete degradation of polyphenols led to the waste
biotransformation into a high-quality compost. Microbiological analyses, carried out for
the assessment of microbial biodiversity and abundance, showed that many bacterial and
fungal populations were dominant and were observed only in specific phases, indicating
the presence of specialized microorganisms with different roles during the
biotransformation of this waste. In particular, the thermophilic phase, in which the highest
degrading activity was recorded, was characterized by the highest biodiversity, while in
correspondence of the chemical stabilization of the process, the communities were
characterized by a lower biodiversity with the community structure that tended to stabilize.
It’s interesting to note that most of the tannin-degrading bacteria were isolated during the
thermophilic phase, suggesting a pivotal role for these populations in the of organic matter
transformation. The identification of fungal populations during the process showed their
strategic role in the process, particularly during the thermophilic phase where
thermotolerant and thermophilic species were found. Interestingly, many of these species
are already known for their ability to degrade complex substances such as lignin or
cellulose.
As a direct consequence of the study about microbial populations involved in the
composting of OMW, bacterial communities of different compost obtained from the same
type of product varying the technological parameters, were also analysed. The aim of this
study was to explore the possible relationship between microbial diversity, composting
technologies and chemical features of the compost produced. The DGGE analysis of the 15
composts showed a great variability of the fingerprinting of bacterial communities.
Interestingly, bacterial diversity seemed negatively correlated with the pH but positively
with the C/N ratio, mainly due to a negative correlation with total nitrogen. Co-inertia
analysis of the co inertia showed that the diversity of compost binds to the maturation
process. Indeed, compost with a low complexity of bacterial community indicated a
stabilization of the process, and a maturation of the composted matrix characterized by
values of pH, nitrogen and C/N ratio of a typical mature compost. This analysis confirms
and strengthens the results obtained during the monitoring of the composting process in
which microbial biodiversity was closely linked to the level of maturity of the matrix.
Taken together these indications suggest the use of a possible additional index for the
assessment of the maturity of the compost based on bacterial diversity.
The second part of the thesis work was aimed to evaluating the effects of compost addition
on the indigenous microbiota of contaminated environments, with particular attention to
the fate of the compost microbial communities. With this aim, the TPOMW compost
characterized during the first part of the thesis was used, together with other kind of
composts, to implement two lab-scale bioremediation trials involving a soil historically
contaminated with diesel oil and a drug-spiked sludge.
In the first bioremediation trial, the diesel oil contaminated soil was amended with the
TPOMW compost and two spent mushroom composts (SMC A and SMC P) from the
cultivation of Agaricus bisporus and Pleorotus ostreatus, and incubated for 120 days.
Samples were taken for analyses at regular intervals. The effects of the TPOMW compost
were compared to those of SMC. To study the ecological effects of this remediation
strategy on the indigenous microbial communities, all the composts were used both
sterilized and unsterilized, with the aim of simulating biostimulation (nutrients presents in
composts) and bioaugmentation (biomass of composts), respectively. The DGGE analysis
indicated that adding the compost to the contaminated soil dramatically changed the
bacterial and fungal communities that showed complex and stable fingerprints during all
the incubation period. On the contrary, when the soil was amended with the sterilized
composts the microbial fingerprints showed an evolution from a very simple community
(typical of contaminated soils) to a complex community, rich in biodiversity. qPCR
quantification of bacterial and fungal populations confirmed that the composts provided to
the soil a very rich biomass, while the sterilized composts were able to stimulate the
growth of microbial populations. Taken together, these data suggested that the amendment
with composts, even of very different kind (namely TPOMW compost and SMC), could be
regarded as a bioaugmentation strategy where very complex exogenous communities were
able to win the competition with the endogenous soil microbiota and completely colonize
the contaminated soil. On the contrary, the biostimulation approach, simulated by the
addition of sterilized composts, seemed to stimulate the growth of the endogenous
microbiota that, theoretically, might be the more suitable to achieve the degradation of the
contaminants. Even if chemical data regarding contaminant removal are, at the moment,
not available, it is possible to draw the hypothesis that the addition of compost to
contaminated soil may not be a suitable strategy for bioremediation as the complex
biomass present in this kind of amendment tend to inhibit the potentially active microbial
populations.
The second lab-scale bioremediation trail was based on a sewage sludge contaminated with
several drug residues. To better monitor the capacity of the amendments to stimulate
remediation, the sludge was spiked with known concentrations of carbamazepine, a highly
persistent antiepileptic drug commonly found in this kind of matrix. To investigate the
microbiological effects on indigenous microbiota during the bioremediation of the spiked
sludge, two different kinds of composts derived of OMW were used: TPOMW compost
obtained from normal composting process (and already used in the first bioremediation
trial) and a OMW compost, named “big bag compost” produced with an innovative
procedure involving a stabilization of the waste and a static composting process. As in the
first trial, the composts were used non-sterilized and sterilized to understand if the putative
bioremediation effects were due to either the nutrients or the microbial communities added
with the amendments. During the 30 days of trial the microbial communities dynamics
were monitored by the DGGE and qPCR, and together with carbamazepine concentrations.
The use of compost in a contaminated matrix, did not seem to produce satisfactory results,
because the community of compost tended to colonize the substrate, inhibiting the
endogenous microflora that can, potentially, degrade the contaminant. On the contrary, the
supply of nutrients, which are supplied with sterile compost, it seemed to adequately
stimulate indigenous populations by promoting the expression of their degradative
potential, resulting in the removal, even partial, of the contaminant in a relatively shorter
compared to a natural attenuation. As regards fungal communities, while in the control and
in the treatments in which sterilized composts were used was not detected the presence of
any fungal population, if not those attributable to a subsequent colonization of environment
microorganisms, in the sludge treated with the non-sterilized compost, fungal community
suffered a sharp decline of biodiversity probably due to the high concentrations of the drug.
Given these results, and compared with those of bacterial communities, we can assume that
the fungal communities did not have a strong importance on the activity of degradation of
the drug.
This Ph.D. thesis work provided a good demonstration of how microbial ecology studies
can support the optimization of agro-industrial waste valorisation and the definitions of
optimal bioremediation strategies. In particular, it was demonstrated how during the
composting process of OMW, a rapid succession of several specialized microbial
populations drives the organic matter biotransformation that ensures the physico-chemical
changes related to the production of a good quality amendment. It was also shown that
great care should be taken when planning the application of this kind of composts in the
bioremediation of contaminated environments. The rich and complex microbiota that
characterizes these amendments may, in fact, inhibit the degradative potential of
endogenous populations, while biostimulation strategies based on the addition of nutrients
may represent a successful remediation approach.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2734
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