Ruolo della ciclina D3 nel controllo della funzionalità delle cellule staminali del muscolo scheletrico in vivo

Abstract

Il requisito necessario per il differenziamento dei precursori muscolari è che questi abbandonino definitivamente il ciclo cellulare. La progressione e l’arresto del ciclo cellulare sono sotto il controllo di regolatori positivi, quali le chinasi ciclina-dipendenti (CDK) e le loro subunità regolative (le cicline), e di regolatori negativi quali l’inibitore delle CDK p21 e il prodotto del gene retinoblastoma (Rb). In questo contesto la ciclina D3, la cui espressione è indotta dal capostipite dei fattori regolatori miogenici MyoD durante la transizione tra fase proliferativa e differenziamento, rappresenta un’eccezione. La ciclina D3, inoltre, è l’unica ciclina ad accumularsi nei miociti post-mitotici formando complessi chinasici inattivi con CDK4 e p21 e mediandone l’interazione con la forma non fosforilata di pRb. Nel muscolo scheletrico di topo i livelli di espressione della ciclina D3 sono elevati nei primi 14 giorni di vita post-nascita per poi diminuire rapidamente e mantenenersi molto bassi nel corso della vita adulta, così come accade a vari geni regolatori della proliferazione e del differenziamento espressi nelle cellule satelliti attivate che sono responsabili della crescita del muscolo post-nascita. A seguito di danno muscolare l’espressione della ciclina D3 viene nuovamente indotta nel muscolo adulto, insieme a quella dei marcatori delle cellule satelliti attivate, suggerendo un ruolo fisiologico della ciclina D3 nella miogenesi rigenerativa. Per indagare il ruolo della ciclina D3 nella miogenesi adulta abbiamo utilizzato un modello di topo knock-out per la ciclina D3. Abbiamo ossevato che topi adulti ciclina D3-knockout sono caratterizzati da ridotte dimensioni, e, in particolar modo, da una ridotta massa muscolare. Analisi immunoistochimiche condotte sul muscolo scheletrico adulto del topo ciclina D3-/- hanno messo in evidenza un ridotto numero di fibre muscolari e fibre di calibro più piccolo rispetto ad animali wild-type, e un numero minore di cellule satelliti quiescenti associate alle miofibre. Inoltre, la ciclina D3 influenza la proliferazione dei precursori miogenici attivati. Infatti, colture di mioblasti primari ciclina D3-/- mostrano un evidente difetto di proliferazione e sono caratterizzate da una percentuale significativamente minore di cellule in fase S e una maggiore percentuale di cellule in fase G1 e G2/M rispetto ai controlli wild-type. Tuttavia, i mioblasti ciclina D3-/-, seppur soggetti a evidenti difetti proliferativi, sono capaci di differenziare in miotubi multinucleati. Il difetto proliferativo dei precursori miogenici attivati si evince anche da esperimenti condotti su cellule satelliti associate a singole fibre muscolari ex-vivo. Dopo 72h in coltura, i cloni cellulari formati dalle cellule satelliti attivate residenti sulle fibre derivate da topi ciclina D3-/- sono di dimensioni ridotte e contengono una percentuale maggiore di cellule esprimenti il marker di differenziamento miogenina e una percentuale minore di cellule esprimenti Pax7, dunque destinate al self-renewal, rispetto ai controlli WT. Risultati simili sono stati ottenuti in vivo in seguito a danno muscolare indotto in topi WT e ciclina D3-/-. Abbiamo osservato che il processo rigenerativo nel topo ciclina D3-/- è caratterizzato, rispetto al controllo, da un minor tasso proliferativo delle cellule satelliti attivate, un differenziamento precoce delle stesse, e una minore propensione al self-renewal. Negli stadi finali della rigenerazione, la dimensione delle fibre rigenerate nei muscoli mancanti di ciclina D3 è risultata inferiore rispetto a quella dei muscoli WT così come ridotto è risultato il numero di cellule satelliti quiescenti che hanno ripopolato la nicchia di cellule staminali. I risultati descritti in questo lavoro di tesi testimoniano per la prima volta che la ciclina D3 svolge un ruolo funzionale non vicariabile dalle altre cicline di tipo D nel controllo del bilancio tra proliferazione, differenziamento e self-renewal delle cellule progenitrici muscolari.

The irreversible exit from the cell cycle is a necessary requisite for the differentiation of muscle cell precursors. Cell cycle progression and exit from the cell cycle are positively controlled by cell cycle activators, such as the cyclins and cyclin dependent kinases (CDK), and negatively controlled by cell cycle inhibitors, such as the CDK inhibitor p21 and the retinoblastoma (Rb) gene product. In this context, cyclin D3, whose expression is induced by the master myogenic regulatory factor MyoD during the transition from the proliferation to the differentiation stage, represents an exception. Moreover, cyclin D3 is the only cyclin that accumulates in post-mitotic myocytes by forming kinase-inactive complexes with CDK4 and p21 and mediating their interaction with hypophosphorylated pRb. Cyclin D3 protein is expressed at high levels in mouse skeletal muscle in vivo during the first 14 days after birth, but its expression declines to a low level in adult muscle. This expression pattern is similar to that of different proliferation and differentiation regulatory genes expressed in the activated satellite cells, which are involved in the post-natal muscle growth. Upon injury, cyclin D3 expression is induced in adult muscle, together with that of activated satellite cell markers, suggesting a physiological role for cyclin D3 in regenerative myogenesis. To elucidate the role of cyclin D3 in adult myogenesis, we used a cyclin D3 knock-out mouse model. We found that adult cyclin D3 knockout mice are phenotipically carachterized by reduced body size and, in particular, by a reduced muscle mass. Immunohistochemical analysis performed on cyclin D3-/- adult skeletal muscle shows a reduced number of myofibers and a reduced myofiber size as compared to wild-type mice, togheter with a reduced number of myofiber-associated quiescent satellite cells. Moreover, cyclin D3 deficiency affects proliferation of myogenic precursor cells. In fact, cyclin D3-/- primary myoblasts in culture show an evident proliferative defect and are characterized by a significant decrease of the S-phase cell proportion in concomitance with a significant increase of the G1 and G2/M-phase cell population compared with control wild-type myoblasts. However, cyclin D3-/- myoblasts, although characterized by an evident proliferative deficit, are capable of myogenic differentiation. The proliferative deficit of the activated myogenic precursors is observed also by analyzing satellite cells associated with single muscle fibers ex-vivo. After 72h in culture, the clusters formed by activated satellite cells resident on myofibers derived from cyclin D3-/- mice display a reduced number of cells, and contain an increased percentage of cells expressing the differentiation marker myogenin, and a decreased percentage of cells expressing Pax7 (cells destined to self-renewal), compared with wild-type controls. Similar results are obtained from in vivo experiments performed by inducing muscle damage in WT and cyclin D3-/- mice. Indeed, the regenerative process of the cyclin D3-/- muscle is characterized by reduced proliferation of the activated satellite cells, precocious differentiation, and decreased propensity to self-renew. At the end of regeneration, the size of regenerated fiber is smaller in cyclin D3-null muscle than in wild type, and the number of Pax7+ cells repopulating the satellite cell niche was reduced. The results shown in this thesis provide the first evidence that cyclin D3 plays a unique functional role, which is not vicariated by the others D type cyclins, in regulating the correct balance between proliferation, differentiation and selfrenewal of skeletal muscle precursor cell