Ruolo del silenziamento epigenetico di miR-132 attraverso la metilazione del DNA nella patogenesi del cancro alla prostata

Abstract

L’Epigenetica è lo studio dei meccanismi responsabili di cambiamenti ereditabili nelle funzioni del genoma senza alcuna modificazione nella sequenza del DNA. Parte dell’epigenoma è coinvolto nella metilazione delle citosine in regioni ricche di dinucleotidi CpG chiamate “isole CpG” oppure “CpG islands”. Le isole CpG sono localizzate nel promotore e la loro metilazione inibisce la trascrizione genica a valle. Nelle cellule tumorali la metilazione aberrante del promotore determina la diminuzione dell’espressione endogena di una piccola classe di RNA chiamati microRNA (o miRNA). I microRNA inibiscono la traduzione dell’mRNA per regolare il network cellulare. Nel cancro alla prostata, la diminuzione dell’espressione dei microRNA potrebbe contribuire all’inizio e allo sviluppo del cancro, e la causa potrebbe essere l’ipermetilazione del loro promotore. Per analizzare il ruolo del silenziamento epigenetico dei microRNA attraverso la metilazione del DNA nel cancro alla prostata, le cellule normali (PrEC) e tumorali (PC3, DU145 e LNCaP) sono state trattate con il farmaco demetilante 5-aza-2’-deoxycytidine (AZA), inseguito sono stati determinati i cambiamenti d’espressione di 650 miRNA usando la megaplex stemloop RT-qPCR. Dopo aver applicato un’accurata selezione è stato analizzato il pattern di metilazione delle isole CpG a monte di un set di microRNA tramite la methylation specific PCR (MSP). Le isole CpG di miR-18b, miR-132, miR-34b/c, miR-148a, miR-450a and miR-542-3p mostrano un pattern di metilazione congruente con la loro variazione di espressione in risposta all’AZA. L’analisi di metilazione di queste isole CpG in un pannello di 50 campioni umani di cancro alla prostata e 24 campioni di controllo normali hanno mostrato che miR-132 è metilato nel 42% dei tessuti umani di cancro in modo positivamente correlato al Gleason score e alla stadiazione patologica. L’analisi di espressione di miR-132 nel nostro pannello di tessuti ha confermato la sua diminuzione di espressione tramite la metilazione nel tumore. La ri-espressione di miR-132 nelle cellule PC3 ha indotto il distacco delle cellule dalla matrice extracellulare seguita dalla morte cellulare (anoikis). Due proteine coinvolte nell’adesione cellulare [heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF) e Talin2] sono state confermate come target diretti di miR-132. Questi risultati dimostrano che mir-132 è un microRNA la cui diminuzione di espressione è correlata con la metilazione ed ha un ruolo anti-metastatico nel cancro alla prostata controllando l’adesione cellulare. Inoltre, l’espressione di miR-132 o la metilazione delle isole CpG può essere utilizzato come un biomarcatore per la progressione del tumore prostatico e come potenziale strategia terapeutica per il tumore della prostata ad uno stadio avanzato.

Epigenetic refers to heritable changes in gene expression not involving the DNA sequence. Part of the epigenome involves the methylation of cytosine in regions rich of CpG dinucleotides called“CpG islands”. The CpG islands are placed at the promoter regions and their methylation silenced the downstream gene transcription. In cancer aberrant promoter methylation has begun to explain the deregulated expression of small, endogenous RNAs called microRNA (or miRNA). MicroRNAs inhibit mRNA translation to fine tune gene network. In prostate cancer, the downregulation of microRNAs may contribute to cancer initiation and development, and the cause may be their promoter hypermethylation. To screen for epigenetically silenced miRNAs in prostate cancer, prostate normal epithelial (PrEC) and carcinoma cells (PC3, DU145 and LNCaP) were treated with the demethylation agent 5-aza-2’- deoxycytidine (AZA) and subsequently examined the expression changes of 650 miRNAs using megaplex stemloop RT-qPCR. After applying a selection strategy it was analyzed the methylation status of CpG islands upstream a subset of miRNAs by methylation specific PCR (MSP). The CpG islands of miR-18b, miR-132, miR-34b/c, miR-148a, miR-450a and miR-542-3p exhibited methylation patterns congruent with their expression modulations in response to AZA. Methylation analysis of these CpG islands in a panel of 50 human prostate carcinoma specimens and 24 normal controls revealed miR-132 to be methylated in 42% of human cancer cases in a positively manner correlated to total Gleason and tumor stage. Expression analysis of miR-132 in our tissue panel confirmed its downregulation through methylation in tumor. Re-expression of miR-132 in PC3 cells induced cell detachment followed by cell death (anoikis). Two proteins involved in cellular adhesion [heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF) and Talin2] were confirmed as direct targets of miR-132. These results demonstrate that miR-132 is a methylation-silenced miRNA with an antimetastatic role in prostate cancer controlling cellular adhesion, furthermore taking into account the use of miR-132 expression or CpG island methylation as a biomarker for PCa progression and its potential therapeutic strategy for advanced PCa.