Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2701
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dc.contributor.advisorEsti, Marco-
dc.contributor.authorBortone, Nadia-
dc.date.accessioned2015-11-10T10:40:16Z-
dc.date.available2015-11-10T10:40:16Z-
dc.date.issued2013-05-27-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2067/2701-
dc.descriptionDottorato di ricerca in Biotecnologia degli alimentiit
dc.description.abstractD-Tagatose, an isomer of D-galactose, is a rare ketohexose which can potentially be used as a sugar-substitute bulking agent in food and as a reduced energy sweetener. Furthermore, Dtagatose has numerous medical benefits and is being considered as a drug for type II diabetes. The enzymatic isomerization of D-galactose to D-tagatose represents a potential alternative to the recently patented chemical production process of D-tagatose. The enzyme L-arabinose isomerase is able to catalyze this reaction. In particular there is interest in its thermostable forms since the equilibrium is shifted toward D-tagatose at high temperatures (T>60°C). This work was an investigation of the enzyme L-arabinose isomerase (TMAI) from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima, immobilized on epoxy supports for the bioconversion of D-galactose to D-tagatose. The enzyme, as a recombinant protein fused to a His-tag, was expressed in E. coli and produced in 2-liter stirred bioreactors. TMAI extract, a partially purified solution containing TMAI obtained after precipitating heat-denatured proteins following heat treatment (80°C, 20 min) of lysate supernatant, was used for immobilization. A further purification step by IMAC, taking advantage of the His-tag fused to the protein, was used to obtain a purified enzyme to be studied as free enzyme. Epoxy supports (Eu), as such or functionalized with iminodiacetic acid and chelated with copper ion (Eu-Cu) or manganese ion (Mn-Cu) to increase the selectivity of the immobilization process were used for the immobilization starting from the TMAI extract. The best results for the immobilized biocatalysts, characterized in terms of immobilization yield, specific activity and catalytic efficiency determined at 80°C and pH 7.5, were obtained for Cu-Eu supports and were respectively 33.9 mg of TMAI per g ds (dry support), 5.4±1.1 U/g ds and 99±20%. The specific activity of the biocatalyst determined at pH 7.5 decreased 5 times when the temperature was decreased from 80 to 60°C. The immobilized enzyme, incubated at 80 and 90°C in absence of D-galactose for different times, exhibited a higher half-life compared to the free enzyme. However, in the presence of D-galactose, that is under operational conditions, the immobilized enzyme exhibited a lower stability compared to incubation in absence of D-galactose. A screening of three buffer systems each at two levels of pH in activity experiments at 80°C with D-galactose over long incubation times identified Tris-HCl buffer at pH 7.5 as the best system. The effect of different post-immobilization treatments consisting of incubating the immobilized derivatives under conditions that should favour stabilization of the enzyme was studied: combined use of glutaraldehyde and ethylenediamine, high temperature (50°C), high pH (10) and long incubation time (72 h), use of glutaraldehyde. The treatment that resulted in the best operational stability of the immobilized biocatalyst was the one with glutaraldehyde and ethylenediamine. In particular, this treatment was also able to stabilize the quaternary structure of the enzyme, a result that was not obtained when applying the other treatments. A further treatment with mercaptoethanol on the biocatalysts, stabilized with the best method or non stabilized, further increased the specific activity, most likely because it was able to remove the Cu2+ ions from the support, thus avoiding its release in the bioconversion medium and its potential negative effect on the enzyme activity. The results obtained showed that the combined use of different strategies, such as use of enzyme tags, functionalization of epoxy supports, use of a hyperthermophilic enzyme and use of post-immobilization methods for stabilization offers great advantages over other methods in the development of an immobilized-enzyme biocatalyst. Recent studies on D-tagatose bioproduction from D-galactose are focusing on the use of thermophilic enzymes with optimum pH on the acidic side. Another strategy is the use of thermophilic or hyperthermophilic enzymes at temperatures in the range 55-65°C in order to avoid side reactions and deactivation of the enzyme. The use of the methods tested in this work on TMAI coupled with the abovementioned strategies could further improve the operational enzyme stability for D-tagatose isomerisation at high temperatures making this process feasible at the industrial scale.it
dc.description.abstractIl D-tagatosio è un chetoesoso naturale e raro in natura che nel campo alimentare potrebbe essere potenzialmente impiegato come sostituto dello zucchero o come dolcificante. L’isomerizzazione enzimatica del D-galattosio in D-tagatosio rappresenta una potenziale alternativa al processo chimico brevettato di recente. L’enzima L-arabinosio isomerasi è in grado di catalizzare l’isomerizzazione. In particolare c’è interesse sulle sue forme termostabili poiché a T>60°C l’equilibrio è spostato verso il D-tagatosio. Questo lavoro di tesi ha riguardato lo studio dell’enzima L-arabinosio isomerasi (TMAI) dal batterio ipertermofilo Thermotoga maritima, immobilizzato su supporti epossidici, per la conversione del Dgalattosio in D-tagatosio. L’enzima, come proteina ricombinante fusa ad un His-tag è stato espresso per via eterologa in E. coli e prodotto in bioreattori agitati da 2 litri. Il preparato grezzo ottenuto mediante trattamento termico (20 min, 80°C) del supernatante del lisato cellulare è stato utilizzato per l’immobilizzazione, mentre per lo studio dell’enzima libero, l’ulteriore purificazione è stata effettuata mediante cromatografia per affinità con ione metallico immobilizzato (IMAC), sfruttando l’His-tag inserito sulla proteina. Per l’immobilizzazione dell’enzima sono stati utilizzati supporti epossidici (Eu), tal quali oppure funzionalizzati con l’acido iminodiacetico e chelati con lo ione rame (Eu-Cu) per aumentare la selettività del processo di immobilizzazione, a partire dal preparato grezzo. I valori stimati della resa di immobilizzazione, dell’attività specifica e dell’efficienza catalitica dei supporti funzionalizzati, determinati a 80°C e pH 7.5, sono risultati rispettivamente pari a 33.9 mg di TMAI per g ds (supporto secco), 5.4±1.1 U/g ds e 99±20%. L’attività del biocatalizzatore a pH 7.5 diminuiva di circa 5 volte al diminuire della temperatura da 80 a 60°C. L’enzima immobilizzato, incubato a 80 e 90°C in assenza di D-galattosio, per diversi tempi, presentava una vita media superiore rispetto all’enzima libero. In presenza di D-galattosio la stabilità dell’enzima diminuiva. Uno screening in prove di attività su tempi lunghi su tre diversi sistemi tampone ciascuno a due livelli di pH ha permesso di identificare il tampone Tris-HCl a pH 7.5 come miglior sistema. E’ stato studiato l’effetto di diversi trattamenti postimmobilizzazione per la stabilizzazione dell’enzima: uso di glutaraldeide ed etilendiammina, alta temperatura (50°C), alti pH (10) e tempi di incubazione (72 h), uso di glutaraldeide. Il trattamento che ha determinato la migliore stabilità operativa dell’enzima è risultato quello effettuato con glutaraldeide ed etilendiammina. In particolare il trattamento ha stabilizzato anche la struttura quaternaria dell’enzima, risultato che non si è conseguito con l’utilizzo degli altri metodi. Un ulteriore trattamento con mercaptoetanolo sui biocatalizzatori, stabilizzati secondo il metodo risultato migliore o non stabilizzati, ha portato ad un incrementato dell’attività, probabilmente perché in grado di allontanare lo ione Cu2+ dal supporto ed evitare che questo venga rilasciato durante la bioconversione, interferendo negativamente con l’attività dell’enzima. Il biocatalizzatore sviluppato (stabilizzato e trattato con mercaptoetanolo) è stato utilizzato per prove di bioconversione in batch ripetuti in colonne a letto fisso a 80°C. Il catalizzatore non stabilizzato e non trattato con mercaptoetanolo ha mostrato una minore stabilità in condizioni operative. I risultati ottenenti hanno evidenziato come l’uso combinato di diverse strategie, quali l’ingegnerizzazione dell’enzima, la funzionalizzazione dei supporti epossidici, l’uso di un enzima termofilo e l’impiego di tecniche di stabilizzazione post-immobilizzazione offra notevoli vantaggi nello sviluppo di un catalizzatore ad enzimi immobilizzati. La ridotta stabilità operativa a 80°C dei biocatalizzatori sviluppati suggerisce l’uso di temperature di reazione inferiori e intorno a 60°C e l’impiego di enzimi con maggiore attività catalitica.it
dc.language.isoenen
dc.publisherUniversità degli studi della Tuscia - Viterboit
dc.relation.ispartofseriesTesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo-
dc.subjectD-Tagatoseen
dc.subjectThermotoga maritima-
dc.subjectL-Arabinose isomeraseen
dc.subjectEpoxy supportsen
dc.subjectImmobilize enzymeen
dc.subjectD-Tagatosioit
dc.subjectL-Arabinosio isomerasiit
dc.subjectSupporti epossidiciit
dc.subjectEnzima immobilizzatoit
dc.subjectAGR/15-
dc.titleD-tagatose production from D-galactose by immobilized L-arabinose isomerase from Thermotoga maritimaen
dc.title.alternativeProduzione del D-tagatosio da D-galattosio mediante l’enzima L-arabinosio isomerasi immobilizzato proveniente da Thermotoga maritimait
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.rights.accessRightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessen
item.fulltextWith Fulltext-
item.openairetypeDoctoral Thesis-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1en-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
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