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Title: D-tagatose production from D-galactose by immobilized L-arabinose isomerase from Thermotoga maritima
Other Titles: Produzione del D-tagatosio da D-galattosio mediante l’enzima L-arabinosio isomerasi immobilizzato proveniente da Thermotoga maritima
Authors: Bortone, Nadia
Keywords: D-Tagatose;Thermotoga maritima;L-Arabinose isomerase;Epoxy supports;Immobilize enzyme;D-Tagatosio;L-Arabinosio isomerasi;Supporti epossidici;Enzima immobilizzato;AGR/15
Issue Date: 27-May-2013
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
Abstract: 
D-Tagatose, an isomer of D-galactose, is a rare ketohexose which can potentially be used as a
sugar-substitute bulking agent in food and as a reduced energy sweetener. Furthermore, Dtagatose
has numerous medical benefits and is being considered as a drug for type II diabetes.
The enzymatic isomerization of D-galactose to D-tagatose represents a potential alternative to
the recently patented chemical production process of D-tagatose. The enzyme L-arabinose
isomerase is able to catalyze this reaction. In particular there is interest in its thermostable
forms since the equilibrium is shifted toward D-tagatose at high temperatures (T>60°C). This
work was an investigation of the enzyme L-arabinose isomerase (TMAI) from the
hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima, immobilized on epoxy supports for the
bioconversion of D-galactose to D-tagatose. The enzyme, as a recombinant protein fused to a
His-tag, was expressed in E. coli and produced in 2-liter stirred bioreactors. TMAI extract, a
partially purified solution containing TMAI obtained after precipitating heat-denatured
proteins following heat treatment (80°C, 20 min) of lysate supernatant, was used for
immobilization. A further purification step by IMAC, taking advantage of the His-tag fused to
the protein, was used to obtain a purified enzyme to be studied as free enzyme. Epoxy
supports (Eu), as such or functionalized with iminodiacetic acid and chelated with copper ion
(Eu-Cu) or manganese ion (Mn-Cu) to increase the selectivity of the immobilization process
were used for the immobilization starting from the TMAI extract. The best results for the
immobilized biocatalysts, characterized in terms of immobilization yield, specific activity and
catalytic efficiency determined at 80°C and pH 7.5, were obtained for Cu-Eu supports and
were respectively 33.9 mg of TMAI per g ds (dry support), 5.4±1.1 U/g ds and 99±20%. The
specific activity of the biocatalyst determined at pH 7.5 decreased 5 times when the
temperature was decreased from 80 to 60°C. The immobilized enzyme, incubated at 80 and
90°C in absence of D-galactose for different times, exhibited a higher half-life compared to
the free enzyme. However, in the presence of D-galactose, that is under operational
conditions, the immobilized enzyme exhibited a lower stability compared to incubation in
absence of D-galactose. A screening of three buffer systems each at two levels of pH in
activity experiments at 80°C with D-galactose over long incubation times identified Tris-HCl
buffer at pH 7.5 as the best system. The effect of different post-immobilization treatments
consisting of incubating the immobilized derivatives under conditions that should favour
stabilization of the enzyme was studied: combined use of glutaraldehyde and
ethylenediamine, high temperature (50°C), high pH (10) and long incubation time (72 h), use
of glutaraldehyde. The treatment that resulted in the best operational stability of the
immobilized biocatalyst was the one with glutaraldehyde and ethylenediamine. In particular,
this treatment was also able to stabilize the quaternary structure of the enzyme, a result that
was not obtained when applying the other treatments. A further treatment with
mercaptoethanol on the biocatalysts, stabilized with the best method or non stabilized, further
increased the specific activity, most likely because it was able to remove the Cu2+ ions from
the support, thus avoiding its release in the bioconversion medium and its potential negative
effect on the enzyme activity. The results obtained showed that the combined use of different
strategies, such as use of enzyme tags, functionalization of epoxy supports, use of a
hyperthermophilic enzyme and use of post-immobilization methods for stabilization offers
great advantages over other methods in the development of an immobilized-enzyme
biocatalyst. Recent studies on D-tagatose bioproduction from D-galactose are focusing on the
use of thermophilic enzymes with optimum pH on the acidic side. Another strategy is the use
of thermophilic or hyperthermophilic enzymes at temperatures in the range 55-65°C in order
to avoid side reactions and deactivation of the enzyme. The use of the methods tested in this
work on TMAI coupled with the abovementioned strategies could further improve the
operational enzyme stability for D-tagatose isomerisation at high temperatures making this
process feasible at the industrial scale.

Il D-tagatosio è un chetoesoso naturale e raro in natura che nel campo alimentare potrebbe
essere potenzialmente impiegato come sostituto dello zucchero o come dolcificante.
L’isomerizzazione enzimatica del D-galattosio in D-tagatosio rappresenta una potenziale
alternativa al processo chimico brevettato di recente. L’enzima L-arabinosio isomerasi è in
grado di catalizzare l’isomerizzazione. In particolare c’è interesse sulle sue forme termostabili
poiché a T>60°C l’equilibrio è spostato verso il D-tagatosio. Questo lavoro di tesi ha
riguardato lo studio dell’enzima L-arabinosio isomerasi (TMAI) dal batterio ipertermofilo
Thermotoga maritima, immobilizzato su supporti epossidici, per la conversione del Dgalattosio
in D-tagatosio. L’enzima, come proteina ricombinante fusa ad un His-tag è stato
espresso per via eterologa in E. coli e prodotto in bioreattori agitati da 2 litri. Il preparato
grezzo ottenuto mediante trattamento termico (20 min, 80°C) del supernatante del lisato
cellulare è stato utilizzato per l’immobilizzazione, mentre per lo studio dell’enzima libero,
l’ulteriore purificazione è stata effettuata mediante cromatografia per affinità con ione
metallico immobilizzato (IMAC), sfruttando l’His-tag inserito sulla proteina. Per
l’immobilizzazione dell’enzima sono stati utilizzati supporti epossidici (Eu), tal quali oppure
funzionalizzati con l’acido iminodiacetico e chelati con lo ione rame (Eu-Cu) per aumentare
la selettività del processo di immobilizzazione, a partire dal preparato grezzo. I valori stimati
della resa di immobilizzazione, dell’attività specifica e dell’efficienza catalitica dei supporti
funzionalizzati, determinati a 80°C e pH 7.5, sono risultati rispettivamente pari a 33.9 mg di
TMAI per g ds (supporto secco), 5.4±1.1 U/g ds e 99±20%. L’attività del biocatalizzatore a
pH 7.5 diminuiva di circa 5 volte al diminuire della temperatura da 80 a 60°C. L’enzima
immobilizzato, incubato a 80 e 90°C in assenza di D-galattosio, per diversi tempi, presentava
una vita media superiore rispetto all’enzima libero. In presenza di D-galattosio la stabilità
dell’enzima diminuiva. Uno screening in prove di attività su tempi lunghi su tre diversi
sistemi tampone ciascuno a due livelli di pH ha permesso di identificare il tampone Tris-HCl
a pH 7.5 come miglior sistema. E’ stato studiato l’effetto di diversi trattamenti postimmobilizzazione
per la stabilizzazione dell’enzima: uso di glutaraldeide ed etilendiammina,
alta temperatura (50°C), alti pH (10) e tempi di incubazione (72 h), uso di glutaraldeide. Il
trattamento che ha determinato la migliore stabilità operativa dell’enzima è risultato quello
effettuato con glutaraldeide ed etilendiammina. In particolare il trattamento ha stabilizzato
anche la struttura quaternaria dell’enzima, risultato che non si è conseguito con l’utilizzo degli
altri metodi. Un ulteriore trattamento con mercaptoetanolo sui biocatalizzatori, stabilizzati
secondo il metodo risultato migliore o non stabilizzati, ha portato ad un incrementato
dell’attività, probabilmente perché in grado di allontanare lo ione Cu2+ dal supporto ed evitare
che questo venga rilasciato durante la bioconversione, interferendo negativamente con
l’attività dell’enzima. Il biocatalizzatore sviluppato (stabilizzato e trattato con
mercaptoetanolo) è stato utilizzato per prove di bioconversione in batch ripetuti in colonne a
letto fisso a 80°C. Il catalizzatore non stabilizzato e non trattato con mercaptoetanolo ha
mostrato una minore stabilità in condizioni operative. I risultati ottenenti hanno evidenziato
come l’uso combinato di diverse strategie, quali l’ingegnerizzazione dell’enzima, la
funzionalizzazione dei supporti epossidici, l’uso di un enzima termofilo e l’impiego di
tecniche di stabilizzazione post-immobilizzazione offra notevoli vantaggi nello sviluppo di un
catalizzatore ad enzimi immobilizzati. La ridotta stabilità operativa a 80°C dei
biocatalizzatori sviluppati suggerisce l’uso di temperature di reazione inferiori e intorno a
60°C e l’impiego di enzimi con maggiore attività catalitica.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologia degli alimenti
URI: http://hdl.handle.net/2067/2701
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