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Title: Helianthus tuberosus genetic resources: from the plant phenotype to the gene expression analyses during tuber development for studying carbohydrate biosynthesis, tuber biomass productivity, and ancestors of the species
Other Titles: Risorse genetiche di Heliantus tuberosus: dallo studio fenotipico all'analisi dell'espressione genica durante lo sviluppo del tubero per lo studio della biosintesi dei carboidrati, della produzione di biomassa e delle specie ancestrali
Authors: Bizzarri, Marco
Keywords: Jerusalem artichoke;Phenomics;Carbohydrates;Microarray;BAC screening;Ancestors;Topinambur;Fenomica;Carboidrati;Ancestrali;AGR/07
Issue Date: 11-Jun-2013
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
The global warming scenario and the urgent public demand of energy, require most effective solutions in order to mitigate the actual emission levels of greenhouse gases, mainly carbon dioxide, and provide non-polluting and inexpensive energy. Among the alternative sources of energy, biomasses represent the most valid means for achieving the mentioned purposes, providing carbon-negative electricity, heat, biogas and mostly biofuels.
The most attractive next generation biofuel systems are algae and few additional plant species such as the tuber-producing Helianthus tuberosus L. (2n=6x=102, Ht). Ht grow rapidly, shows high carbohydrate content, mainly fructans, and is able to produce 2-3 times more biomass per unit land area than any other annual cropping system as well as a higher bioethanol yield. The high amount of fructans stored in stalks and tubers of Ht leads to the production of bio-ethanol and other energy-storage chemicals upon microbial hydrolysis and fermentation. In addition, Ht has a high nitrogen and water use efficiency, utilize nutrient-rich waste water, and is resistant/tolerant to pathogens and pests.
Integrating phenomic, transcriptomic, metabolomic, and genomic approaches into a breeding program aimed to enhance Ht tuber biomass production is the most efficient strategy that, currently, convey efforts towards the establishment of a research-based platform for the production of carbon-negative biofuels, and for this reason this strategy has been adopted for this dissertation.
By carrying out a phenomic study, the phenotypic variability extant among 67 different clones belonging to sub-primary both wild and cultivated gene pool grown in the Experimental Farm of University of Tuscia, were evaluated for morphological (tuber shape, plant architecture and height) and physiological (date of beginning of tuber enlargement, flowering time, resistance to biotic and abiotic stimuli) traits related to the tuber biomass production.
‘K8-HS142’, selected by a half-sib progeny of the cultivated ‘K8’ clone and the cultivated ‘Violet de Rennes’ (‘VR’) were the best Ht clones detected to be suitable for biomass production. The monostem ‘K8-HS142’ forming spindle-shaped tubers and the semi-brushy and branched ‘VR’ forming short-pear shaped tubers resulted the most attractive clones because of their highest production in rainfed (18 ton ha-1) and water supply (20 ton ha-1) conditions, respectively, as well as for other phenotypic traits such as drought resistance and precocity of flowering (‘K8-HS142’) and powdery mildew resistance and precocity of tuberization (‘VR’).
The fructan content during tuber development at the three crucial stages of initial tuberization (T0), active growth (T3) and final maturation (Tm) was determined by carrying out a metabolomic study and a maximum content of 425 and 450 g kg-1 of dry matter was ascertained for ‘K8-HS142’ and ‘VR’ at T3 when water supply conditions occurred.
The analysis regarding the tuber content of starch evidenced substantial lacking of that polysaccharide in the mature tuber from ‘K8-HS142’ and ‘VR’ clones.
Because of their different i) tuber biomass yields and tuber carbohydrate content from both rainfed and irrigated conditions, ii) tuber shape and precocity of tuberization and iii) plant architecture fitting high (‘K8-HS142’) and low plant density (‘VR’) cropping systems, the most productive ‘K8-HS142’ in rainfed condition and the ‘VR’ (used as control), were chosen in order to carry out a transcriptomic study focused on the expression analysis regarding the set of genes encoding for enzymatic and structural proteins involved in carbohydrate biosynthesis and storage during the tuber development.
The expression level of a set of 6,365 ESTs selected from the CHT(LMS)_library of 41,000 Ht EST sequences annotated to genes included in pathways for tuber carbohydrate biosynthesis and storage using Blast2GO® bioinformatic tool were used for the microarray analysis based on the CombiMatrix© technology performed at the developmental stages of cessation of rhizome elongation-beginning of apical meristem differentiation for tuberization (T0), active tuber development (T3) and tuber maturation (Tm).
A total of 123 and 11 ESTs were differentially expressed between the two Ht clones at T0 and T3, respectively, whereas no ESTs were differentially expressed at Tm. In both clones, 11 and 127 different ESTs were discovered differentially expressed between T0 and T3 and T0 and Tm respectively, whereas no ESTs displayed a differential expression between T3 and Tm. Those results reasonably suggest that the highest gene expression for carbohydrate biosynthesis occur during the initial tuberization stage T0 - T3 and that a peculiar peak expression occur for 11 genes at the T3 stage.
Furthermore, 12 ESTs of genes specifically involved in both fructan and starch biosynthesis were significantly expressed at high level during tuber development. Those ESTs encode for enzymes implied in fructan polymerization into the vacuole (Sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase [1SST], Fructan:fructan 1-fructosyltransferase [1FFT], Sucrose H+/symporter [SuSym]) and starch biosynthesis into the amyloplast (Starch synthase [SS], Sucrose phosphate phosphatase [SuPP], Glucose 6P/P translocator [G6PT], -invertase [INV], Phosphoglucomutase [PGM], Sucrose synthase [SuSy], UDPG pyrophosphorilase [UDPGP]).
The ESTs for 1SST and 1FFT were found up to 3 times more expressed than SS, suggesting that the fructan polymerization prevailed over starch polymerization and explain why fructans are the major tuber storage carbohydrate. However the magnitude of expression produced by genes dealing with carbohydrate biosynthesis allowed to possibly suppose their activity in the starch biosynthetic network.
The expression pattern of the 1SST-ESTs was in line with the expected function of the encoded 1SST enzyme. In fact, the fructan biosynthesis starts with the intervention of the 1SST enzyme which catalyze the synthesis of the triose 1-kestose from two sucrose molecules, which in turn is used by 1FFT as starting building-block for the further polymerization of fructans by adding fructose monomers to the growing fructan chain.
Two other 1SST-ESTs with 73% and 100% sequence identity to the 1SST-EST from Allium sativum (As) and Cichorium intybus (Ci), respectively, were also highly expressed during the T0-T3 tuber developmental stage. The presence in Ht of additional genes orthologous to genes from other plant species encoding for 1SST suggests the pivotal role of 1SST in fructan accumulation in organs for vegetative propagation in both Monocotyledons and Dicotyledons and the allopolyploid origin of the hexaploid Ht from diploid with common ancestry to other Asterceae. That is in line with the evidence that Helianthus genus is one of the most evolutionary diverse groups of organisms whose biodiversity represents a rich resource for bioprospecting orthologous genes related not only to fructan biosynthesis, but also to other genes expressed in heterotrophic tissues of carbohydrate storage organs.
Performing the genomic study, the polymorphism for amplicons from genes above mentioned involved in carbohydrate biosynthesis (except SuSym, UDPGP, SuPP) was determined in diploid-non-tuberizing (H. annuus, H. argophyllus, H. niveus, 2n=2x=34), diploid-tuberizing (H. maximilianii, H. angustifolius, H. decapetalus and H. nuttalli, 2n=2x=34), tetraploid-tuberizing (H. hirsutus, H. strumosus, 2n=4x=68) and hexaploid-tuberizing (H. schweinitzii, Ht, 2n=2x=102) Helianthus species. The amplicon lengths were used to explore the average similarity among species using the Dice index (DSI) with respect to ESTs for 1SST and SS in order to depict a reliable
genealogy of Ht, and prepare a bioprospection of amplicons to clone new homeoalleles for improving Ht ability to produce tuber biomass.
A striking monomorhpism was detected for amplicons from 1FFT, SuS, PGM, SuSym, while a strong and light polymorphism was evidenced for amplicons from 1SST, SS and INV, G6PT, respectively. Non-tuberizing diploid had a larger polymorphism than tuberizing diploid, which indicate that the higher polymorphism in tetraploid and hexaploid Helianthus species might be the a signature of a parental non-tuberizing diploid species in the pedigree of polyploid Helianthus.
The non-tuberizing annual diploid H. annuus had highest average similarity (DSI=0.50) to Ht which make it a relevant species for exploring the genome of the putative diploid ancestor of Ht.
The tetraploid-tuberizing species H. hirsutus had also a high average similarity to Ht (DSI=0.46) which make it a robust candidate as tetraploid ancestor of Ht.
The genomic tools have also been used for setting the stage for identification and exploration of the genome sequence of the regulatory regions in Ht 1SST and 1FFT genes.
A representative subset of 55,296 clones of a sunflower BAC library prepared from the nuclear genome of the Helianthus annuus (Ha) ‘line 89’ was screened to detect cloned DNA inserts encoding the 1SST and 1FFT enzymes using the 1SST and 1FFT amplicons from Ht as probes. The BAC library covering 5 times the sunflower haploid genome was screened by using a pool of 10 different 32P-labelled probes was prepared from the selected amplicons after PCR of the DNA from the Ht clones ‘CSR’ (a feral Ht-type from Latium, Italy) and ‘CU-3B’ (a cultivated clone from Hungary) and the Ha ‘line 89’ taken as control.
A total of 23 different positive BAC clones were detected, paving the way to next sequencing and identification of promoter regions useful for exploring polymorphism extant among Helianthus species for those DNA sequences.

Lo scenario determinato dal riscaldamento globale dell’atmosfera terrestre da un lato e la sempre più pressante domanda di energia dall’altro, richiedono soluzioni più efficaci al fine di mitigare i livelli effettivi delle emissioni di gas serra, soprattutto anidride carbonica, e di rifornire energia non inquinante a basso costo. Tra le fonti alternative di energia, le biomasse rappresentano uno dei mezzi più validi per il conseguimento degli scopi citati, poiché consentono di produrre energia sottoforma di elettricità, calore, biogas e biocombustibili garantendo un bilancio netto di anidride carbonica favorevole durante il ciclo produttivo.
Tra i più interessanti sistemi produttivi finalizzati alla produzione di biocarburanti di nuova generazione sono da ritenere le alghe e alcune specie di piante coltivate, quali Helianthus tuberosus L. (2n = 6x = 102, Ht).
Helianthus tuberosus è una specie perenne che si caratterizza per la formazione di organi sotterranei di riserva, i tuberi, la capacità di estrinsecare il proprio ciclo colturale velocemente, l’alto contenuto in carboidrati, soprattutto fruttani, degli steli, branche e tuberi, essendo in grado di produrre biomassa per unità di superficie 2-3 volte in più rispetto a qualsiasi altra specie annuale, ed infine per il superiore rendimento in bioetanolo.
L'elevata quantità di fruttani accumulati e di altri prodotti chimici che consentono l’immagazzinamento di energia nella parte aerea delle piante e nei tuberi, consente una altrettanto elevata produzione di bioetanolo attraverso i processi chimici di idrolisi e fermentazione microbica.
Inoltre, Helianthus tuberosus mostra una elevata efficienza d’uso dell’azoto e dell'acqua irrigua, risponde molto bene alla fertirrigazione operata con acque reflue e di rifiuto degli allevamenti, ed è resistente/tollerante ai patogeni e parassiti.
Per tutti questi motivi Helianthus tuberosus è una specie particolarmente adatta al disegno di agroecosistemi finalizzati alla produzione di biocarburanti che richiedo bassi input energetici.
L'integrazione di approcci metodologici di fenomica, trascrittomica, metabolomica e genomica è la strategia più efficace ai fini della conduzione di un programma di miglioramento genetico teso a permettere la selezione di nuovi cloni di Ht in grado di fornire una più elevata produzione di biomassa nei tuberi e biocarburanti, secondo un approccio produttivo low-input. Per questo motivo è stata adottato questa strategia di ricerca negli studi compendiati in questa tesi.
Attraverso la realizzazione di uno studio di fenomica, la variabilità fenotipica esistente tra 67 diversi cloni appartenenti al sub-gene pool primario, sia selvatico che coltivato di Helianthus tuberosus, allevati nelle parcelle dell’Azienda Agraria Sperimentale dell'Università della Tuscia, è stata valutata per vari caratteri delle piante, morfologici (forma e peso dei tuberi, tipo di habitus vegetativo ed altezza), fisiologici (precocità di tuberizzazione e di fioritura, resistenza a stimoli biotici e abiotici) ed agronomici (produzione di biomassa nei tuberi).
'K8-HS142', clone selezionato da una progenie half-sib del clone coltivato 'K8' ed il clone coltivato 'Violet de Rennes' ('VR') sono risultati i migliori in relazione alla capacità diretta ed indiretta di produrre biomassa nei tuberi.
Infatti, 'K8-HS142', il cui habitus vegetativo è monostelo, formante tuberi allungati-ellissoidali e 'VR', clone invece ramificato e formante tuberi piriformi, hanno mostrato rispettivamente le più alte rese di sostanza secca nei tuberi in asciutto (18 t ha-1) ed irriguo (20 t ha-1) così come altri notevoli tratti fenotipici quali la resistenza agli stress idrici e la precocità di fioritura ('K8-HS142') e la resistenza all'oidio e la precocità di tuberizzazione ('VR').
Il contenuto di fruttani durante le tre fasi cruciali di sviluppo del tubero di tuberizzazione iniziale (T0), attiva crescita (T3) e maturazione finale (Tm) è stato determinato effettuando uno studio metabolomico dal quale è emerso che un tenore massimo di 425 e 450 g kg-1 di sostanza secca venne prodotto da 'K8-HS142' e 'VR' allo stadio T3, in condizioni irrigue.
L'analisi biochimica del contenuto di amido nei tuberi maturi di 'K8-HS142' e 'VR' ha evidenziato una sostanziale assenza di tale polisaccaride.
A causa delle loro diverse produzioni in biomassa dei tuberi in condizioni irrigue a non, dei diversi contenuti di fruttani nei tuberi, della diversa forma dei tuberi e precocità di tuberizzazione e del diverso habitus vegetativo adatto per alte ('K8-HS142') e basse ('VR') densità di impianto nei sistemi colturali, il clone più produttivo in condizioni non irrigue, K8-HS142 ' e 'VR' (usato come controllo), sono stati scelti in modo da realizzare uno studio trascrittomico focalizzato sulla analisi di espressione per quanto riguarda il gruppo di geni che codificano per enzimi e proteine strutturali coinvolti nella biosintesi dei carboidrati e nella loro accumulazione durante lo sviluppo del tubero.
Il livello di espressione di un set di 6.365 ESTs selezionate dalla libreria di espressione di Ht CHT(LMS)_norm costituita da 41.000 sequenze ESTs, la cui annotazione tramite lo strumento bioinformatico Blast2GO ® consentì di allinearle a geni identificati per codificare proteine enzimatiche e strutturali implicate nella biosintesi ed accumulazione dei carboidrati durante lo sviluppo del tubero, è stato analizzato mediante un esperimento di genomica funzionale microarray basato sulla tecnologia CombiMatrix©, eseguito durante le fasi di inizio della tuberizzazione (T0), attivo sviluppo del tubero (T3) e maturazione fisiologica (Tm).
Due gruppi di 123 e 11 ESTs sono stati identificati per includere ESTs trovate espresse in modo differenziale tra i due cloni ‘K8-HS142’ e ‘VR’ in T0 e T3, rispettivamente, mentre nessuna EST è risultata differenzialmente espressa in Tm. In entrambi i cloni, 11 e 127 ESTs sono stati determinate come differenzialmente espresse tra gli stadi di sviluppo T0 e T3 e T0 e Tm rispettivamente, mentre nessuna EST ha evidenziato una espressione differenziale tra gli stadi di sviluppo T3 e Tm.
Tali risultati ragionevolmente indicano che l'espressione genica differenziale per le proteine enzimatiche e strutturali implicate nella biosintesi dei carboidrati si manifesta in modo più evidente durante la fase iniziale di tuberizzazione T0 - T3 e che un picco di espressione occorre per 11 geni allo stadio T3.
Inoltre, 12 geni le cui ESTs furono identificate per essere specificamente coinvolte nella biosintesi dei fruttani e dell’amido sono risultate significativamente espresse ad elevati livelli durante lo sviluppo del tubero.
Tali ESTs codificano per gli enzimi implicati nella polimerizzazione dei fruttani nel vacuolo (Sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase [1SST], Fructan:fructan 1-fructosyltransferase [1FFT], Sucrose H+/symporter [SuSym]) e biosintesi dell’amido nell’amiloplasto (Starch synthase [SS], Sucrose phosphate phosphatase [SuPP], Glucose 6P/P translocator [G6PT], -invertase [INV], Phosphoglucomutase [PGM], Sucrose synthase [SuSy], UDPG pyrophosphorilase [UDPGP]).
Le ESTs codificanti per gli enzimi chiave della biosintesi dei fruttani 1SST e 1FFT sono state trovate fino a 3 volte più espresse rispetto alla EST per SS, enzima che favorisce la polimerizzazione dell’amido, il che suggerisce che la polimerizzazione dei fruttani prevale su quella dell'amido e spiega perché i fruttani sono i principali carboidrati di riserva del tubero.
Tuttavia l’entità dell'espressione prodotta dei geni coinvolti nelle vie metaboliche dell’amido, lascia ritenere che essi siano attivi, sebbene il contenuto di amido nei tuberi è molto basso.
Il pattern di espressione temporale delle ESTs codificanti per 1SST è stato in linea con la funzione prevista per tale enzima. Infatti, la biosintesi dei fruttani inizia con l'intervento dell'enzima 1SST che catalizza la sintesi del trioso 1-kestosio da due molecole di saccarosio, che a sua volta viene utilizzato dall’enzima 1FFT per l'ulteriore polimerizzazione, aggiungendo monomeri di fruttosio alla catena polisaccaridica crescente.
Altri due ESTs codificanti per l’enzima 1SST con il 73% e il 100% di identità di sequenza verso geni per 1SST di Allium sativum (As) e Cichorium intybus (Ci), rispettivamente, sono state trovate altamente espresse durante la fase di sviluppo T0-T3 del tubero. La presenza in Ht di ulteriori geni ortologhi ai geni di altre specie vegetali codificanti per 1SST, suggerisce il ruolo centrale dell’enzima nella accumulazione dei fruttani negli organi di moltiplicazione vegetativa sia nelle Monocotiledoni che Dicotiledoni e l'origine allopoliploide dell’esaploide Ht da specie diploidi appartenenti alla famiglia delle Asteraceae. Ciò è in linea con l'evidenza che il genere Helianthus è uno dei più variegati e complessi dal punto di vista evolutivo e della biodiversità, includendo specie rappresentanti utili risorse per la prospezione non solo dei geni ortologhi implicati nella biosintesi dei fructani, ma anche di altri geni espressi nei tessuti eterotrofi del tubero in cui i carboidrati sono accumulati.
Il polimorfismo degli ampliconi PCR prodotto dai geni le cui ESTs risultarono altamente espresse durante lo sviluppo del tubero e governanti la biosintesi dei carboidrati (ad eccezione di SuSym, UDPGP, SuPP), è stato analizzato mediante uno studio genomico per il complesso di specie del genere Helianthus diploidi e non tuberizzanti (H. annuus, H. argophyllus, H. niveus, 2n=2x=34), diploidi e tuberizzanti (H. maximilianii, H. angustifolius, H. decapetalus and H. nuttalli, 2n=2x=34), tetraploidi e tuberizzanti (H. hirsutus, H. strumosus, 2n=4x=68) ed infine esaploidi e tuberizzanti (H. schweinitzii, Ht, 2n=2x=102).
La lunghezza degli ampliconi è stata utilizzata per determinare la similarità media tra le specie calcolando l’indice di similarità di Dice (DSI) in riferimento alle ESTs codificanti per gli enzimi 1SST ed SS, allo scopo di dedurre una possibile genealogia per Ht. Inoltre lo studio del polimorfismo è stato eseguito allo scopo di individuare nuovi omeoalleli utili al miglioramento della capacità di Ht di produrre carboidrati e quindi biomassa nei tuberi.
Un stretto monomorfismo è stato determinato per gli ampliconi risultanti dalla amplificazione PCR delle ESTs per 1FFT, SuS, PGM, SuSym, mentre un ampio e ridotto polimorfismo sono risultati, rispettivamente, dall’amplificazione PCR delle ESTs per 1SST, SS e INV, G6PT. Le specie diploidi non tuberizzanti hanno manifestato un polimorfismo più ampio delle specie diploidi e tuberizzanti, il che indica che l’ampio polimorfismo osservato tra le specie tetraploidi ed esaploidi del genere Helianthus potrebbe suggerire la presenza dei genomi delle specie diploidi e non tuberizzanti nel pedigree delle poliploidi.
La specie diploide non tuberizzante H. annuus ha evidenziato il più alto indice di similarità medio verso Ht (DSI=0.50), ciò che rende la più rinomata e coltivata specie del genere Helianthus un possibile ancestrale diploide di Ht.
Anche la specie tetraploide e tuberizzante H. hirsutus evidenziò un alto indice di similarità verso Ht (DSI=0.46) e dunque potrebbe assurgere al ruolo di parentale tetraploide di Ht.
Gli studi genomici sono stati pure usati per dare la stura alla identificazione ed esplorazione nel genoma di Ht delle regioni di regolazione dei geni codificanti per 1SST ed 1FFT.
Un sottoinsieme di 55.296 inserti di DNA rappresentativo di una libreria BAC di girasole preparata dal DNA nucleare della linea ‘89’ è stata sottoposta a screening al fine di individuare i frammenti di DNA clonati codificanti per gli enzimi 1SST ed 1FFT usando quali sonde marcate gli ampliconi PCR ottenuti dalle ESTs di Ht codificanti per tali enzimi. La libreria BAC si caratterizzò per avere una dimensione totale dei frammenti clonati
di DNA pari a 5 volte il genoma aploide di girasole ed è stata sottoposta a screening impiegando un pool di 10 differenti sonde marcate con l’isotopo 32P preparate da ampliconi PCR selezionati dai cloni di Ht ‘CSR’ (tipo selvatico originario del Lazio) e ‘CU-3B’ (un genotipo selezionato dal clone coltivato ‘Ungheria’) e la linea ‘89’ di girasole quale controllo.
Un complesso di 23 cloni BAC è risultato positivo all’analisi, consentendo il successivo sequenziamento dei geni per 1SST ed 1FFT e l’identificazione dei promotori, con i quali esplorare il polimorfismo esistente tra le specie del genere Helianthus per quelle sequenze di DNA.
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
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