Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2682
Title: Design and development of environmental friendly products and processes for food safety and biosensoring
Other Titles: Disegno e sviluppo di prodotti e processi ecocompatibili per la sicurezza alimentare e la biosensoristica
Authors: Bozzini, Tiziana
Keywords: Biocatalisi;Immobilizzazione tirosinasi;Antiossidante;Biocatalysis;Immobilized tyrosinase;Antioxidant;CHIM/06
Issue Date: 30-May-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 25. ciclo
Abstract: 
This work concerns topics of food safety. With the aim to preserve the quality, nutritional
value and chemical composition of foods, we studied the synthesis of novel antioxidant
compounds, and prepared simple scaffolds based on the immobilization of enzymes on
epoxy resins and carbon nanotubes (CNTs) for synthetic and biosensoring purposes. To
achieve this goal we synthesized antioxidants characterized by two pharmacophores, the
catechol moiety and a long carbon side-chain, able to give important biological properties
at the new molecules. Our synthetic strategy was based on two enzymes, lipase from
Candida antarctica and tyrosinase from Agaricus bisporus. The use of enzymes as
biocatalysts has received an increasing interest for the synthesis of organic compounds,
because they have a high catalytic efficiency and selectivity, that allow the specific
recognition of substrates and products, even in complex mixtures. Furthermore, these
biocatalysts generally work under mild conditions of reaction: pH near to neutrality,
temperatures below 100°C and at atmospheric pressure (in few words they are
environmental friendliness). As a general procedure, a large panel of acid phenols was
esterified by lipase from Candida antarctica to introduce a carbon side-chain on the
aromatic ring able to increase the solubility in the lipid cellular compartments. The esters
were then directly oxidized by tyrosinase from Agaricus bisporus, to give catechols.
Subsequently, the two enzymes were used in cascade (in only one step) to give the desired
products in a more shorter multi-enzimatic pathway, reducing time and costs of reaction.
Since there are some limits in the use of enzymes (i.e. because of their low stability, high
cost of production, possible inhibition by impurities, difficulty to be recovered from the
mixtures, etc.), we also applied some immobilization procedures. The immobilization
techniques offer the possibility to separate the enzyme from the product, and reuse it in
continuous production processes. For this reasons, tyrosinase was immobilized on the
epoxidic resin Eupergit-CM, and then the new biocatalyst was covered with
polyelectrolytes by the Layer-by-Layer method. The novel heterogeneous biocatalysts
were used for the synthesis of catechols and fully characterized for their storage stability
and the possibility to reuse in novel reactions. All new products were evaluated for their
antioxidant activity in vitro through DPPH assay. Data showed that the antioxidant activity
was present only with the catechol function, and increased by increasing the length of
lipophilic side chain. Since antioxidant compounds are not important only for food safety,
but also to the human health, the new products were also evaluated for the antiviral
activity against influenza A virus. New products show two important activities: antioxidant
and antiviral properties.
These results were applied to another important molecules, L-DOPA, that have an
important role in the mechanism of enzymatic browning of foods and a considerable effect
on several diseases of the central nervous system, mainly caused by oxidative damage. So
new bioactive 3,4-dihydroxyphenylalanine peptidomimetics were synthesized with a
similar approach. In particular, N-BOC protected amino acids were used as a nucleophile
to study the addition on a reactive DOPA-quinone intermediate, generated by in situ
oxidation of L-DOPA. Finally, tyrosinase was immobilized on multi-wall carbon
nanotubes (MW-CNTs) and used as catalyst for the oxidation of phenols to corresponding
catechols in organic solvent. The new catalysts performed the oxidation with a similar
selectivity, but a minor amount of enzyme was required respect to previously described
systems based on epoxy resins. This means a significant advantage in terms of cost
savings. The new biocatalyst immobilized on CNTs could be used also as biosensor to
detect the presence of phenols and catechols in foods.

Questo lavoro riguarda temi di sicurezza alimentare. Con l'obiettivo di preservare la
qualità, il valore nutrizionale e la composizione chimica degli alimenti, abbiamo studiato
la sintesi di nuovi composti antiossidanti, e preparati sistemi semplici basati sull’
immobilizzazione degli enzimi su resine epossidiche e nanotubi di carbonio (CNT) per
scopi sintetici e biosensoring. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo sintetizzato
molecole antiossidanti caratterizzati da due gruppi farmacofori, costituiti dalla porzione
catecolica e da una lunga catena laterale di carbonio, in grado di dare importanti proprietà
biologiche alle nuove molecole. La nostra strategia sintetica si è basata su due enzimi, la
lipasi di Candida antarctica e la tirosinasi di Agaricus bisporus. L'uso di enzimi come
biocatalizzatori ha ricevuto un crescente interesse per la sintesi di composti organici,
poiché hanno una elevata efficienza catalitica e selettività, che permette loro il
riconoscimento specifico di substrati e prodotti, anche in miscele complesse. Inoltre, questi
biocatalizzatori generalmente lavorano in condizioni blande di reazione: pH vicino alla
neutralità, temperature inferiori a 100°C e alla pressione atmosferica (in poche parole sono
eco-compatibili). Come procedura generale, un gruppo di fenoli acidi sono stati esterificati
con lipasi di Candida antarctica per introdurre una catena laterale di carbonio sull'anello
aromatico in grado di aumentare la solubilità nei compartimenti cellulari lipidici. Poi gli
esteri così ottenuti sono stati direttamente ossidati da tirosinasi di Agaricus bisporus, per
dare catecoli. Successivamente, i due enzimi sono stati usati in cascata (in un solo step) per
dare i prodotti desiderati in un processo multi-enzimatico più breve, riducendo tempi e
costi di reazione. Tuttavia ci sono alcuni limiti nell'uso di enzimi (ad esempio la loro bassa
stabilità, elevati costi di produzione, possibile inibizione da impurità, difficoltà ad essere
recuperati dalle miscele, ecc), per questo abbiamo applicato alcune procedure di
immobilizzazione enzimatica, che offrono la possibilità di separare l'enzima dal prodotto, e
riutilizzarlo in una produzione in continuo. Per questo motivo, la tirosinasi è stata
immobilizzata su una resina epossidica Eupergit-CM e il nuovo biocatalizzatore ricoperto
con polielettroliti attraverso il metodo Layer-by-Layer. I nuovi biocatalizzatori eterogenei
sono stati usati per la sintesi di catecoli e caratterizzati per la loro stabilità catalitica
durante la conservazione e la possibilità di essere riutilizzati in nuove reazioni.
Tutti i nuovi prodotti sono stati valutati per la loro attività antiossidante in vitro mediante
test DPPH. I risultati hanno mostrato che l'attività antiossidante è presente solo con la
funzione catecolica e aumenta con l’allungamento della catena laterale lipofila. Poiché
composti antiossidanti non sono importanti solo per la sicurezza alimentare, ma anche per
la salute umana, i nuovi prodotti sono anche stati valutati per l'attività antivirale contro
virus. I nuovi prodotti mostrano due importanti attività: proprietà antiossidanti e antivirali.
Questi risultati sono stati applicati ad altre molecole, L-DOPA, che hanno un ruolo
importante nel meccanismo di imbrunimento degli alimenti e un notevole effetto su
malattie del sistema nervoso centrale, principalmente causate da danno ossidativo. Quindi
nuovi peptidomimetici 3,4- diidrossifenilalanina bioattivi sono stati sintetizzati con un
approccio simile. In particolare, aminoacidi N-BOC protetti sono stati usati come
nucleofili per studiare il loro legame con il DOPA-chinone, generato dall’ossidazione in
situ di L-DOPA. Infine, la tirosinasi è stata immobilizzata su nanotubi di carbonio a parete
multipla (MW-CNTs) e usata come catalizzatore per l'ossidazione dei fenoli nei
corrispondenti catecoli in solvente organico. I nuovi catalizzatori hanno eseguito la
reazione di ossidazione con una selettività simile, ma una minore quantità di enzima
rispetto ai sistemi precedentemente descritti a base di resine epossidiche. Questo significa
un notevole vantaggio in termini di risparmio di costi. Il nuovo biocatalizzatore
immobilizzato su CNTs potrebbe anche essere usato come biosensore per rilevare la
presenza di fenoli e catecoli negli alimenti.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2682
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