Design and development of environmental friendly products and processes for food safety and biosensoring

Abstract

This work concerns topics of food safety. With the aim to preserve the quality, nutritional value and chemical composition of foods, we studied the synthesis of novel antioxidant compounds, and prepared simple scaffolds based on the immobilization of enzymes on epoxy resins and carbon nanotubes (CNTs) for synthetic and biosensoring purposes. To achieve this goal we synthesized antioxidants characterized by two pharmacophores, the catechol moiety and a long carbon side-chain, able to give important biological properties at the new molecules. Our synthetic strategy was based on two enzymes, lipase from Candida antarctica and tyrosinase from Agaricus bisporus. The use of enzymes as biocatalysts has received an increasing interest for the synthesis of organic compounds, because they have a high catalytic efficiency and selectivity, that allow the specific recognition of substrates and products, even in complex mixtures. Furthermore, these biocatalysts generally work under mild conditions of reaction: pH near to neutrality, temperatures below 100°C and at atmospheric pressure (in few words they are environmental friendliness). As a general procedure, a large panel of acid phenols was esterified by lipase from Candida antarctica to introduce a carbon side-chain on the aromatic ring able to increase the solubility in the lipid cellular compartments. The esters were then directly oxidized by tyrosinase from Agaricus bisporus, to give catechols. Subsequently, the two enzymes were used in cascade (in only one step) to give the desired products in a more shorter multi-enzimatic pathway, reducing time and costs of reaction. Since there are some limits in the use of enzymes (i.e. because of their low stability, high cost of production, possible inhibition by impurities, difficulty to be recovered from the mixtures, etc.), we also applied some immobilization procedures. The immobilization techniques offer the possibility to separate the enzyme from the product, and reuse it in continuous production processes. For this reasons, tyrosinase was immobilized on the epoxidic resin Eupergit-CM, and then the new biocatalyst was covered with polyelectrolytes by the Layer-by-Layer method. The novel heterogeneous biocatalysts were used for the synthesis of catechols and fully characterized for their storage stability and the possibility to reuse in novel reactions. All new products were evaluated for their antioxidant activity in vitro through DPPH assay. Data showed that the antioxidant activity was present only with the catechol function, and increased by increasing the length of lipophilic side chain. Since antioxidant compounds are not important only for food safety, but also to the human health, the new products were also evaluated for the antiviral activity against influenza A virus. New products show two important activities: antioxidant and antiviral properties. These results were applied to another important molecules, L-DOPA, that have an important role in the mechanism of enzymatic browning of foods and a considerable effect on several diseases of the central nervous system, mainly caused by oxidative damage. So new bioactive 3,4-dihydroxyphenylalanine peptidomimetics were synthesized with a similar approach. In particular, N-BOC protected amino acids were used as a nucleophile to study the addition on a reactive DOPA-quinone intermediate, generated by in situ oxidation of L-DOPA. Finally, tyrosinase was immobilized on multi-wall carbon nanotubes (MW-CNTs) and used as catalyst for the oxidation of phenols to corresponding catechols in organic solvent. The new catalysts performed the oxidation with a similar selectivity, but a minor amount of enzyme was required respect to previously described systems based on epoxy resins. This means a significant advantage in terms of cost savings. The new biocatalyst immobilized on CNTs could be used also as biosensor to detect the presence of phenols and catechols in foods.

Questo lavoro riguarda temi di sicurezza alimentare. Con l'obiettivo di preservare la qualità, il valore nutrizionale e la composizione chimica degli alimenti, abbiamo studiato la sintesi di nuovi composti antiossidanti, e preparati sistemi semplici basati sull’ immobilizzazione degli enzimi su resine epossidiche e nanotubi di carbonio (CNT) per scopi sintetici e biosensoring. Per raggiungere questo obiettivo abbiamo sintetizzato molecole antiossidanti caratterizzati da due gruppi farmacofori, costituiti dalla porzione catecolica e da una lunga catena laterale di carbonio, in grado di dare importanti proprietà biologiche alle nuove molecole. La nostra strategia sintetica si è basata su due enzimi, la lipasi di Candida antarctica e la tirosinasi di Agaricus bisporus. L'uso di enzimi come biocatalizzatori ha ricevuto un crescente interesse per la sintesi di composti organici, poiché hanno una elevata efficienza catalitica e selettività, che permette loro il riconoscimento specifico di substrati e prodotti, anche in miscele complesse. Inoltre, questi biocatalizzatori generalmente lavorano in condizioni blande di reazione: pH vicino alla neutralità, temperature inferiori a 100°C e alla pressione atmosferica (in poche parole sono eco-compatibili). Come procedura generale, un gruppo di fenoli acidi sono stati esterificati con lipasi di Candida antarctica per introdurre una catena laterale di carbonio sull'anello aromatico in grado di aumentare la solubilità nei compartimenti cellulari lipidici. Poi gli esteri così ottenuti sono stati direttamente ossidati da tirosinasi di Agaricus bisporus, per dare catecoli. Successivamente, i due enzimi sono stati usati in cascata (in un solo step) per dare i prodotti desiderati in un processo multi-enzimatico più breve, riducendo tempi e costi di reazione. Tuttavia ci sono alcuni limiti nell'uso di enzimi (ad esempio la loro bassa stabilità, elevati costi di produzione, possibile inibizione da impurità, difficoltà ad essere recuperati dalle miscele, ecc), per questo abbiamo applicato alcune procedure di immobilizzazione enzimatica, che offrono la possibilità di separare l'enzima dal prodotto, e riutilizzarlo in una produzione in continuo. Per questo motivo, la tirosinasi è stata immobilizzata su una resina epossidica Eupergit-CM e il nuovo biocatalizzatore ricoperto con polielettroliti attraverso il metodo Layer-by-Layer. I nuovi biocatalizzatori eterogenei sono stati usati per la sintesi di catecoli e caratterizzati per la loro stabilità catalitica durante la conservazione e la possibilità di essere riutilizzati in nuove reazioni. Tutti i nuovi prodotti sono stati valutati per la loro attività antiossidante in vitro mediante test DPPH. I risultati hanno mostrato che l'attività antiossidante è presente solo con la funzione catecolica e aumenta con l’allungamento della catena laterale lipofila. Poiché composti antiossidanti non sono importanti solo per la sicurezza alimentare, ma anche per la salute umana, i nuovi prodotti sono anche stati valutati per l'attività antivirale contro virus. I nuovi prodotti mostrano due importanti attività: proprietà antiossidanti e antivirali. Questi risultati sono stati applicati ad altre molecole, L-DOPA, che hanno un ruolo importante nel meccanismo di imbrunimento degli alimenti e un notevole effetto su malattie del sistema nervoso centrale, principalmente causate da danno ossidativo. Quindi nuovi peptidomimetici 3,4- diidrossifenilalanina bioattivi sono stati sintetizzati con un approccio simile. In particolare, aminoacidi N-BOC protetti sono stati usati come nucleofili per studiare il loro legame con il DOPA-chinone, generato dall’ossidazione in situ di L-DOPA. Infine, la tirosinasi è stata immobilizzata su nanotubi di carbonio a parete multipla (MW-CNTs) e usata come catalizzatore per l'ossidazione dei fenoli nei corrispondenti catecoli in solvente organico. I nuovi catalizzatori hanno eseguito la reazione di ossidazione con una selettività simile, ma una minore quantità di enzima rispetto ai sistemi precedentemente descritti a base di resine epossidiche. Questo significa un notevole vantaggio in termini di risparmio di costi. Il nuovo biocatalizzatore immobilizzato su CNTs potrebbe anche essere usato come biosensore per rilevare la presenza di fenoli e catecoli negli alimenti.