Integration of native and engineered photosynthetic microorganisms into artificial assemblies for the development of promising biosensors targeted to environmental monitoring

Abstract

The aim of this PhD project is the development and optimization of photosynthetic biosensors for monitoring environmental contaminants (e.g. herbicides). Were simultaneously followed two research lines: the aim of the first one was the production of an electrochemical biosensor based on whole algal cells activity of the genus Chlamydomonas, the second line to develop a chimeric biomedietor consisting union of protein sequences derived from purple bacterium photosynthetic Reaction Centers (RCs), Rhodobacter sphaeroides and Chlamydomonas algae for the development of an electrochemical biosensor. The second research line aspired to create sensing element with the sensitivity characteristics of a typical eukaryotic reaction center, and the bacterial reaction center stability. About the electrochemical biosensor based on photosynthetic activity of C. reinhardtii whole cells immobilized on Screen Printed Electrode (SPEs) after two alternative immobilization procedures have been tested on the selected biomediator: a first one based on coating with a polymer called Nafion® was deeply explored, while the second one consisting in the biomediator entrapment within a calcium-alginate gel. Particular attention has been dedicated to the above mentioned alginate immobilization procedure, revealed to be much more promising than the Nafion® one. Dose-response curves were carried out for two different herbicide, a triazine type, the other type of urea and determined some important parameters of the biosensor. Very sensitive analyte Limit of Detection (LOD) were obtained, reaching a LOD equal to 6x10-9 M for the herbicide Linuron and 9x10-8M for the herbicide simazine. The data analysis obtained from the dose-response curves and the recovery experiments, suggested the existence of a second binding site for plastochinone in Chlamydomonas, in agreement with recent literature data that indicate the presence in some species of plants and cyanobacteria. The electrode with immobilized algae can be stored for a month at room temperature without losing functionality. About the second research line a feasibility bioinformatic study was carried out to check what was the optimal molecular biology approach to improve the sensitivity of Rhodobacter sphaeroides toward herbicides, and we decided to try to create a Chimera to melt the sensitivity characteristic toward herbicides of algae Photosystem II (PSII), with the stability characteristic of bacterial RC. Regarding the chimera, construction, we proceeded with the nucleotide sequence selection and identification of the encoding region of Chlamydomonas interest protein by bioinformatics analysis, and its subsequent synthesis by PCR and cloning into plasmid vector pCR®2.1. Once cloned and amplified, the interest sequence was excised and then cloned into two different Rhodobacter expression vectors: a gene coding sequences containing only the photosynthetic reaction center (LM, H), which also contains other gene coding sequences of the LH1 antenna. The recombinant strains were then grown and used for the extraction of photosynthetic membranes. The visible absorption spectrum showed that the chimeric reaction center is present at low concentrations, although in different quantities in both transformants. The low concentrations may be due to assembly problems and/or stability problems that will require further analysis to determine the functionality, stability and the ability to bind herbicides for its possible future use as biomediator.

L’obbiettivo del presente progetto di dottorato è lo sviluppo e l'ottimizzazione di biosensori basati sull'attività fotosintetica utili per il monitoraggio ambientale di contaminanti (es. erbicidi). Sono state seguite simultaneamente due linee di ricerca: la prima avente come scopo la realizzazione di un biosensore elettrochimico basato sull'attività di cellule algali intere del genere Chlamydomonas; la seconda volta allo sviluppo di un biomediatore chimerico, costituito dall'unione di sequenze proteiche derivanti dai centri di reazione fotosintetica di un batterio purpureo, Rhodobacter sphaeroides e dell'alga Chlamydomonas per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico. Con questa seconda linea di ricerca si ambiva a creare un elemento di “sensing” con le caratteristiche di sensibilità tipiche di un centro di reazione eucariotico e con quelle di stabilità di un centro di r eazione batterico. Per quanto riguarda la prima linea di ricerca sono state studiate due differenti procedure di immobilizzazione: la prima basata sul rivestimento con un polimero denominato Nafion®, (un copolimero solfonato tetrafluoreetilenico); la seconda sull’immobilizzazione delle alghe intere con un gel di Alginato di sodio la quale, dati i promettenti risultati ottenuti, è stata ottimizzata sviluppando un biosensore notevolmente sensibile e stabile. A questo proposito sono state determinate le curve dose-risposta relative a due diversi erbicidi, uno di tipo triazinico, l'altro di tipo ureico e sono stati anche determinati alcuni importanti parametri di funzionamento del biosensore. I limiti di rivelazione ottenuti per l'analita sono risultati molto sensibili (Limit Of Detection, LOD), raggiungendo un LOD pari a 6x10-9 M per l’erbicida Linuron e a 9x10-8M per l'erbicida Simazina . L'analisi dei dati ottenuti dalle curve dose-risposta e gli esperimenti di reversibilità dell'inibizione determinata dall'interazione con l'analita, hanno suggerito l'esistenza di un secondo sito di legame per il plastochinone in Chlamydomonas, in accordo con recenti dati in letteratura che ne indicano la presenza in alcune specie vegetali e in cianobatteri. Test di stabilità sugli elementi di trasduzione hanno evidenziato che gli elettrodi con immobilizzate le alghe intere possono essere conservati per un mese circa a temperatura ambiente senza perdita di funzionalità. Nello sviluppo della seconda linea di ricerca è stato eseguito uno studio bioinformatico per valutare quale era l’approccio di biologia molecolare da attuare per il miglioramento della sensibilità di Rhodobacter sphaeroides verso gli erbicidi, il risultato è la sintesi di una chimera che unisca le caratteristiche di sensibilità agli erbicidi del Fotosistema II (PSII) delle alghe, con le caratteristiche di stabilità dell’RC batterico.Per la realizzazione della chimera, si è proceduto con la selezione e definizione della sequenza nucleotidica di Chlamydomonas codificante la regione proteica di interesse mediante analisi bioinformatiche, la sua successiva sintesi mediante PCR ed infine il clonaggio nel vettore plasmidico pCR® 2.1. Una volta clonata ed amplificata, la sequenza di interesse è stata escissa e successivamente clonata in due diversi vettori di espressione in Rhodobacter: uno contenente le sequenze geniche codificanti il solo centro di reazione fotosintetico (L, M, H), l'altro contenente anche le sequenze geniche codificanti delle antenne LH1. I ceppi ricombinanti sono stati quindi coltivati ed utilizzati per l'estrazione delle membrane fotosintetiche. Lo spettro di assorbimento nel visibile ha evidenziato che il Centro di Reazione chimerico è presente a basse concentrazioni, seppur in quantità diverse, in entrambi i trasformanti. La bassa concentrazione può essere dovuta sia a problemi di assemblaggio che a problemi di stabilità, saranno necessarie ulteriori analisi per definire la funzionalità, la stabilità e la capacità di legare gli erbicidi per il suo futuro possibile utilizzo come biomediatore.