Caratteristiche strutturali e diversità delle comunità microbiche in sistemi acquatici ad alta variabilità ambientale: analisi dei batteri planctonici e dei biofilm

Abstract

Il lavoro sperimentale condotto nell’ambito del Dottorato di Ricerca in Ecologia e Gestione delle Risorse Biologiche ha riguardato lo studio delle comunità batteriche in ambienti acquatici sottoposti ad un diverso impatto antropico. In particolare, sono state caratterizzate - le comunità batteriche planctoniche in un ambiente marino-costiero lungo un gradiente di trofia delle acque (costa-largo); - le comunità batteriche associate a biofilm in ambiente fluviale lungo un gradiente di inquinamento delle acque (montevalle). La prima parte dell’attività di ricerca (capitolo 3.1) era inserita in uno studio multidisciplinare del CNR dal titolo “Stima dei flussi biogenici di CO2 in sistemi acquatici” che aveva come scopo generale quello di comprendere il ruolo dei microrganismi negli scambi di CO2 tra i sistemi marino-costieri e l’atmosfera. In particolare l’attenzione è stata focalizzata sulle dinamiche strutturali e sull'attività delle comunità microbiche in aree a diverso stato trofico. Le indagini di campo sono state svolte sui campioni raccolti durante due campagne oceanografiche effettuate nel mese di Marzo e di Novembre 2009 nel Mare Adriatico Settentrionale lungo un transetto perpendicolare alla costa. Lo studio della struttura di comunità ha previsto l’utilizzo di tecniche biomolecolari di ibridazione in situ (CARD-FISH) mentre la diversità filogenetica è stata analizzata tramite il sequenziamento del 16S rDNA e la costruzione di librerie di cloni. L’attività cellulare è stata studiata per mezzo dell’incorporazione di Bromodeossiuridina (BrdU-CARD). Questo studio è stato preceduto da una prima fase di ottimizzazione delle tecniche, anche attraverso la collaborazione e la permanenza per un periodo di tre mesi presso i laboratori del Max Planck Institute for Marine Microbiology (Brema, Germania). I risultati ottenuti mostrano come nel mese di Marzo si assista ad una completa instabilità della colonna d’acqua, caratteristica tipicamente invernale mentre nel mese di Novembre, la colonna d’acqua presenta una stratificazione termica, riconducibile ad una condizione di fine estate. Ulteriori differenze tra le due campagne sono state osservate anche per quanto riguarda le condizioni trofiche delle acque, con una situazione di oligotrofia nel mese di Marzo e di mesotrofia in Novembre, con acque più ricche in nutrienti nelle stazioni costiere e nei siti più superficiali delle stazioni intermedie. In questo contesto la comunità batterica ha mostrato delle forti relazioni con le caratteristiche chimico-fisiche della colonna d’acqua sia in termini di abbondanza che di composizione della comunità. La comunità batterica nelle stazioni costiere raggiunge densità più alte rispetto alle stazioni più al largo; al contrario, non si osservano cambiamenti significativi con il variare della profondità. Nel mese di Marzo la bassa concentrazione di fosforo e l’alto valore del rapporto N/P (156.3) sembrano limitare la crescita batterica. Nel mese di Novembre, il più elevato stato trofico delle acque si riflette in una maggiore abbondanza batterica ed i nutrienti sembrano giocare un ruolo minore nel limitare la crescita batterica, si osserva, infatti, un basso valore del rapporto N/P (7.6) più vicino al rapporto ottimale per la biomassa batterica. Anche l’attività della comunità, misurata come tasso di duplicazione cellulare tramite l’incorporazione di BrdU, mostra valori più elevati nelle stazioni costiere (in particolare nel mese di Novembre). Per quanto riguarda la dinamica dei gruppi filogenetici analizzati, seppur si osservi sempre una forte dominanza degli Alpha-Proteobacteria (con percentuali che raggiungono il 51% di tutte le cellule batteriche visualizzate), la composizione della comunità microbica mostra una forte stagionalità. Nel mese di Marzo si osserva una distribuzione più omogenea dei vari gruppi rispetto a Novembre in cui si evidenzia un aumento dei Cytophaga-Flavobacteria contrapposto ad un netto decremento dell’abbondanza relativa del gruppo dei Gamma-Proteobacteria. L’abbondanza del gruppo degli Alpha- Proteobacteria, con una forte presenza di sequenze relative al ceppo SAR11 prettamente marino (come evidenziato nelle quattro librerie di cloni per un totale di 230 sequenze) conferma l’adattabilità di questo gruppo a variazioni nelle concentrazione dei nutrienti, soprattutto nitrati, lungo il gradiente trofico. Il gruppo dei Cytophaga- Flavobacteria risulta essere fortemente influenzato dalla presenza di un gradiente di salinità e dall’alta concentrazione di materia organica particolata di derivazione alloctona. L’ abbondanza di questo gruppo risulta maggiore sotto costa in relazione a un maggior apporto di materiale organico di derivazione fluviale. Questo dato trova conferma inoltre nella presenza di sequenze associate al genere Fluvicola, prettamente d’acqua dolce, a dimostrazione della forte influenza degli apporti fluviali sulla linea di costa. Anche gli Actinobacteria, gruppo tipico d’acqua dolce, sono stati ritrovati solo nelle stazioni più prossime alla costa. La contestuale presenza di microrganismi prettamente marini e di acqua dolce sottocosta conferma quindi il carattere ecotonale di queste zone in cui la composizione della comunità microbica risulta fortemente determinata dal rimescolamento di masse d’acqua di diversa origine. Le comunità microbiche sono quindi influenzate in termini di abbondanza, di attività e di composizione filogenetica dalle caratteristiche chimico-fisiche della colonna d’acqua, che a loro volta risentono fortemente della stagionalità. La seconda parte del lavoro di Dottorato (capitolo 3.2) è focalizzata sulle comunità microbiche associate a biofilm in ambienti fluviali soggetti a forte impatto antropico. Le variazioni strutturali della comunità sono state studiate tramite l’applicazione della tecnica CARD-FISH. Tale studio, parte integrante di un progetto di ricerca di scambio tra IRSA e Università di Girona (Spagna), è stato effettuato lungo un gradiente di inquinamento monte-valle nel fiume Llobregat (Barcellona). Dopo i 25 giorni di accrescimento, si registra una minore abbondanza batterica nel sito con un minore impatto antropico, mentre nei siti maggiormente inquinati l’abbondanza microbica raggiunge valori significativamente più alti. Inoltre, è stato possibile osservare come nel sito a minore impatto, la comunità presenti una più omogenea distribuzione dei gruppi filogenetici analizzati, mentre nei siti a valle prevalgono i gruppi degli Alpha- e dei Beta-Proteobacteria. Per comprendere come le dinamiche della comunità batterica rispondano ad un diverso livello di impatto antropico si è proceduto alla traslocazione dei biofilm da acque provenienti da siti meno contaminati a quelle maggiormente inquinate. Interessante notare che dopo la traslocazione le comunità cresciute in zone a monte tendano ad assomigliare a quelle presenti nelle aree più impattate. Questi risultati mostrano come le caratteristiche qualitative delle acque rappresentino un fattore estremamente importante nella strutturazione delle comunità microbiche bentoniche e confermano che l’analisi delle risposte qualitative e quantitative delle comunità batteriche potrebbe diventare uno strumento essenziale sia come indice di qualità delle acque sia come early warning system per la contaminazione ambientale. L’ultima parte della tesi (capitolo 3.3) è stata focalizzata sulla messa a punto della CARD-FISH in combinazione con la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) per l’applicazione a biofilm direttamente attaccati al substrato di crescita, mantenendone inalterata la loro architettura. Fino ad ora, infatti, i microrganismi presenti nel biofilm venivano analizzati tramite tecniche che prevedevano il distacco e la disgregazione dell’aggregato, con perdita di importanti informazioni sulla distribuzione spaziale dei ceppi batterici. La messa a punto di questo metodo offre quindi la possibilità di visualizzare i singoli ceppi batterici all’interno della struttura tridimensionale del biofilm durante le fasi di sviluppo con importanti implicazioni nello studio delle successioni microbiche.

The studies, carried out within the Doctorate, aimed to investigate the structure and the function of the microbial community in different aquatic environments subject to anthropogenic impacts. The Thesis was focused on assessing the structure and diversity of the bacterioplankton in coastal waters with different trophic status and of the bacterial community in riverine microbial biofilms, along a gradient of increasing pollution. The first part of the thesis (Chapter 3.1) was part of a CNR project on the role of bacteria in the carbon cycle in the Adriatic Sea. Bacterial abundance and diversity were assessed by molecular techniques (16S rDNA cloning and sequencing, CARD-FISH), while bacterial activity was estimated by immunofluorescence techniques (BrdU incorporation). All samples were collected during two oceanographic cruises (March and November 2009) along a coastal-offshore transect with increasing values of nutrients concentration. The results showed high seasonality in the water chemicophysical characteristics passing from an oligotrophic state in March to a mesotrophic state in November. In March, the low P concentration and the high values of N/P ratio (156.3) seemed to limit the bacterial growth. In November, the increasing P concentration and the N/P ratio (7.6) closed to the optimal value for bacterial growth, brought to a higher bacterial activity and abundance, with higher values in the coastal sites. Bacterial community structure was also related to the chemical-physical characteristics. The community was dominated by the Alpha-Proteobacteria, typical of marine environment and favoured by the low concentrations of nutrients; Cytophaga- Flavobacteria showed a decreasing abundance in the offshore samples directly related to particle organic matter (POC) concentration. The presence of Actinobacteria, typical of the freshwater environments, found in higher percentages in the coastal stations also confirmed the importance of freshwater input along the Adriatic coast. 230 sequences were analyzed for 4 clone-library from surface and deep samples. Clone library showed that the Alpha-Proteobacteria were mainly represented by with the genus SAR11 while Gamma-Proteobacteria by Alteromonadales and many sequences of Cytophaga- Flavobacteria were affiliated with Flavobacteriales. The second part of the thesis (Chapter 3.2) was focused on the microbial communities associated to biofilm in riverine environments. The study, carried out in the context of an Italy-Spain exchange project, was aimed to investigate the effect of water pollution on bacterial communities in Llobregat River, Spain. Bacterial abundance was lower in the site subject to a lower antrophic impact in comparison with the downstream sites where the community showed higher abundance. In these sites a dominance of Alphaand Beta-Proteobacteria was observed. To better understand how the bacterial communities respond to the pollutant impacts, biofilms growth in less polluted sites were exposed to water from downstream sites in a traslocation experiment. At the end of the experiment, the traslocated biofilm quickly became similar to the biofilm in the impacted sites. Our results showed that quantitative and qualitative assessment of the bacterial community composition could become an useful indicator of the water quality and an early warning system for environmental changes. The last part of thesis (Chapter 3.3), was focused on the optimization of CARD-FISH protocol in combination with Confocal Laser Scanning Microscopy for the inspection of riverine intact biofilm attached to the original substrate for simultaneous identification and spatial localization of cells. Bacterial community composition was assessed during the biofilm development by using artificial substrates following the dynamics of specific bacterial clusters. Overall, we demonstrated that bacterial successional changes can be described by applying the CARD-FISH protocol to intact biofilms, which are ultimately from rivers, thereby avoiding biofilm detachment or manipulations. Our approach, in combination with an appropriate image analysis procedure, could contribute to elucidate how specific bacterial clusters participate to the development of the complex biofilm structures and the mechanisms that regulate community composition dynamic and cell dispersion in aquatic environments.