Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2526
Title: Caratteristiche strutturali e diversità delle comunità microbiche in sistemi acquatici ad alta variabilità ambientale: analisi dei batteri planctonici e dei biofilm
Authors: Lupini, Giuliano
Keywords: CARD-FISH;Comunità batterica planctonica;Biofilm;BIO/07
Issue Date: 20-Mar-2012
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 24. ciclo
Abstract: 
Il lavoro sperimentale condotto nell’ambito del Dottorato di Ricerca in Ecologia e
Gestione delle Risorse Biologiche ha riguardato lo studio delle comunità batteriche in
ambienti acquatici sottoposti ad un diverso impatto antropico. In particolare, sono state
caratterizzate - le comunità batteriche planctoniche in un ambiente marino-costiero
lungo un gradiente di trofia delle acque (costa-largo); - le comunità batteriche associate
a biofilm in ambiente fluviale lungo un gradiente di inquinamento delle acque (montevalle).
La prima parte dell’attività di ricerca (capitolo 3.1) era inserita in uno studio
multidisciplinare del CNR dal titolo “Stima dei flussi biogenici di CO2 in sistemi
acquatici” che aveva come scopo generale quello di comprendere il ruolo dei
microrganismi negli scambi di CO2 tra i sistemi marino-costieri e l’atmosfera. In
particolare l’attenzione è stata focalizzata sulle dinamiche strutturali e sull'attività delle
comunità microbiche in aree a diverso stato trofico. Le indagini di campo sono state
svolte sui campioni raccolti durante due campagne oceanografiche effettuate nel mese
di Marzo e di Novembre 2009 nel Mare Adriatico Settentrionale lungo un transetto
perpendicolare alla costa. Lo studio della struttura di comunità ha previsto l’utilizzo di
tecniche biomolecolari di ibridazione in situ (CARD-FISH) mentre la diversità
filogenetica è stata analizzata tramite il sequenziamento del 16S rDNA e la costruzione
di librerie di cloni. L’attività cellulare è stata studiata per mezzo dell’incorporazione di
Bromodeossiuridina (BrdU-CARD). Questo studio è stato preceduto da una prima fase
di ottimizzazione delle tecniche, anche attraverso la collaborazione e la permanenza per
un periodo di tre mesi presso i laboratori del Max Planck Institute for Marine
Microbiology (Brema, Germania). I risultati ottenuti mostrano come nel mese di Marzo
si assista ad una completa instabilità della colonna d’acqua, caratteristica tipicamente
invernale mentre nel mese di Novembre, la colonna d’acqua presenta una
stratificazione termica, riconducibile ad una condizione di fine estate. Ulteriori
differenze tra le due campagne sono state osservate anche per quanto riguarda le
condizioni trofiche delle acque, con una situazione di oligotrofia nel mese di Marzo e
di mesotrofia in Novembre, con acque più ricche in nutrienti nelle stazioni costiere e
nei siti più superficiali delle stazioni intermedie. In questo contesto la comunità
batterica ha mostrato delle forti relazioni con le caratteristiche chimico-fisiche della
colonna d’acqua sia in termini di abbondanza che di composizione della comunità. La
comunità batterica nelle stazioni costiere raggiunge densità più alte rispetto alle
stazioni più al largo; al contrario, non si osservano cambiamenti significativi con il
variare della profondità. Nel mese di Marzo la bassa concentrazione di fosforo e l’alto
valore del rapporto N/P (156.3) sembrano limitare la crescita batterica. Nel mese di
Novembre, il più elevato stato trofico delle acque si riflette in una maggiore
abbondanza batterica ed i nutrienti sembrano giocare un ruolo minore nel limitare la
crescita batterica, si osserva, infatti, un basso valore del rapporto N/P (7.6) più vicino al
rapporto ottimale per la biomassa batterica. Anche l’attività della comunità, misurata
come tasso di duplicazione cellulare tramite l’incorporazione di BrdU, mostra valori
più elevati nelle stazioni costiere (in particolare nel mese di Novembre). Per quanto
riguarda la dinamica dei gruppi filogenetici analizzati, seppur si osservi sempre una
forte dominanza degli Alpha-Proteobacteria (con percentuali che raggiungono il 51%
di tutte le cellule batteriche visualizzate), la composizione della comunità microbica
mostra una forte stagionalità. Nel mese di Marzo si osserva una distribuzione più
omogenea dei vari gruppi rispetto a Novembre in cui si evidenzia un aumento dei
Cytophaga-Flavobacteria contrapposto ad un netto decremento dell’abbondanza
relativa del gruppo dei Gamma-Proteobacteria. L’abbondanza del gruppo degli Alpha-
Proteobacteria, con una forte presenza di sequenze relative al ceppo SAR11
prettamente marino (come evidenziato nelle quattro librerie di cloni per un totale di 230
sequenze) conferma l’adattabilità di questo gruppo a variazioni nelle concentrazione
dei nutrienti, soprattutto nitrati, lungo il gradiente trofico. Il gruppo dei Cytophaga-
Flavobacteria risulta essere fortemente influenzato dalla presenza di un gradiente di
salinità e dall’alta concentrazione di materia organica particolata di derivazione
alloctona. L’ abbondanza di questo gruppo risulta maggiore sotto costa in relazione a un
maggior apporto di materiale organico di derivazione fluviale. Questo dato trova
conferma inoltre nella presenza di sequenze associate al genere Fluvicola, prettamente
d’acqua dolce, a dimostrazione della forte influenza degli apporti fluviali sulla linea di
costa. Anche gli Actinobacteria, gruppo tipico d’acqua dolce, sono stati ritrovati solo
nelle stazioni più prossime alla costa. La contestuale presenza di microrganismi
prettamente marini e di acqua dolce sottocosta conferma quindi il carattere ecotonale di
queste zone in cui la composizione della comunità microbica risulta fortemente
determinata dal rimescolamento di masse d’acqua di diversa origine. Le comunità
microbiche sono quindi influenzate in termini di abbondanza, di attività e di
composizione filogenetica dalle caratteristiche chimico-fisiche della colonna d’acqua,
che a loro volta risentono fortemente della stagionalità.
La seconda parte del lavoro di Dottorato (capitolo 3.2) è focalizzata sulle comunità
microbiche associate a biofilm in ambienti fluviali soggetti a forte impatto antropico.
Le variazioni strutturali della comunità sono state studiate tramite l’applicazione della
tecnica CARD-FISH. Tale studio, parte integrante di un progetto di ricerca di scambio
tra IRSA e Università di Girona (Spagna), è stato effettuato lungo un gradiente di
inquinamento monte-valle nel fiume Llobregat (Barcellona). Dopo i 25 giorni di
accrescimento, si registra una minore abbondanza batterica nel sito con un minore
impatto antropico, mentre nei siti maggiormente inquinati l’abbondanza microbica
raggiunge valori significativamente più alti. Inoltre, è stato possibile osservare come
nel sito a minore impatto, la comunità presenti una più omogenea distribuzione dei
gruppi filogenetici analizzati, mentre nei siti a valle prevalgono i gruppi degli Alpha- e
dei Beta-Proteobacteria. Per comprendere come le dinamiche della comunità batterica
rispondano ad un diverso livello di impatto antropico si è proceduto alla traslocazione
dei biofilm da acque provenienti da siti meno contaminati a quelle maggiormente
inquinate. Interessante notare che dopo la traslocazione le comunità cresciute in zone a
monte tendano ad assomigliare a quelle presenti nelle aree più impattate. Questi
risultati mostrano come le caratteristiche qualitative delle acque rappresentino un
fattore estremamente importante nella strutturazione delle comunità microbiche
bentoniche e confermano che l’analisi delle risposte qualitative e quantitative delle
comunità batteriche potrebbe diventare uno strumento essenziale sia come indice di
qualità delle acque sia come early warning system per la contaminazione ambientale.
L’ultima parte della tesi (capitolo 3.3) è stata focalizzata sulla messa a punto della
CARD-FISH in combinazione con la microscopia confocale a scansione laser (CLSM)
per l’applicazione a biofilm direttamente attaccati al substrato di crescita,
mantenendone inalterata la loro architettura. Fino ad ora, infatti, i microrganismi
presenti nel biofilm venivano analizzati tramite tecniche che prevedevano il distacco e
la disgregazione dell’aggregato, con perdita di importanti informazioni sulla
distribuzione spaziale dei ceppi batterici. La messa a punto di questo metodo offre
quindi la possibilità di visualizzare i singoli ceppi batterici all’interno della struttura
tridimensionale del biofilm durante le fasi di sviluppo con importanti implicazioni nello
studio delle successioni microbiche.

The studies, carried out within the Doctorate, aimed to investigate the structure and the
function of the microbial community in different aquatic environments subject to
anthropogenic impacts. The Thesis was focused on assessing the structure and diversity
of the bacterioplankton in coastal waters with different trophic status and of the
bacterial community in riverine microbial biofilms, along a gradient of increasing
pollution.
The first part of the thesis (Chapter 3.1) was part of a CNR project on the role of
bacteria in the carbon cycle in the Adriatic Sea. Bacterial abundance and diversity were
assessed by molecular techniques (16S rDNA cloning and sequencing, CARD-FISH),
while bacterial activity was estimated by immunofluorescence techniques (BrdU
incorporation). All samples were collected during two oceanographic cruises (March
and November 2009) along a coastal-offshore transect with increasing values of
nutrients concentration. The results showed high seasonality in the water chemicophysical
characteristics passing from an oligotrophic state in March to a mesotrophic
state in November. In March, the low P concentration and the high values of N/P ratio
(156.3) seemed to limit the bacterial growth. In November, the increasing P
concentration and the N/P ratio (7.6) closed to the optimal value for bacterial growth,
brought to a higher bacterial activity and abundance, with higher values in the coastal
sites. Bacterial community structure was also related to the chemical-physical
characteristics. The community was dominated by the Alpha-Proteobacteria, typical of
marine environment and favoured by the low concentrations of nutrients; Cytophaga-
Flavobacteria showed a decreasing abundance in the offshore samples directly related
to particle organic matter (POC) concentration. The presence of Actinobacteria, typical
of the freshwater environments, found in higher percentages in the coastal stations also
confirmed the importance of freshwater input along the Adriatic coast. 230 sequences
were analyzed for 4 clone-library from surface and deep samples. Clone library showed
that the Alpha-Proteobacteria were mainly represented by with the genus SAR11 while
Gamma-Proteobacteria by Alteromonadales and many sequences of Cytophaga-
Flavobacteria were affiliated with Flavobacteriales.
The second part of the thesis (Chapter 3.2) was focused on the microbial communities
associated to biofilm in riverine environments. The study, carried out in the context of
an Italy-Spain exchange project, was aimed to investigate the effect of water pollution
on bacterial communities in Llobregat River, Spain. Bacterial abundance was lower in
the site subject to a lower antrophic impact in comparison with the downstream sites
where the community showed higher abundance. In these sites a dominance of Alphaand
Beta-Proteobacteria was observed. To better understand how the bacterial
communities respond to the pollutant impacts, biofilms growth in less polluted sites
were exposed to water from downstream sites in a traslocation experiment. At the end
of the experiment, the traslocated biofilm quickly became similar to the biofilm in the
impacted sites. Our results showed that quantitative and qualitative assessment of the
bacterial community composition could become an useful indicator of the water quality
and an early warning system for environmental changes.
The last part of thesis (Chapter 3.3), was focused on the optimization of CARD-FISH
protocol in combination with Confocal Laser Scanning Microscopy for the inspection of
riverine intact biofilm attached to the original substrate for simultaneous identification
and spatial localization of cells. Bacterial community composition was assessed during
the biofilm development by using artificial substrates following the dynamics of
specific bacterial clusters. Overall, we demonstrated that bacterial successional changes
can be described by applying the CARD-FISH protocol to intact biofilms, which are
ultimately from rivers, thereby avoiding biofilm detachment or manipulations. Our
approach, in combination with an appropriate image analysis procedure, could
contribute to elucidate how specific bacterial clusters participate to the development of
the complex biofilm structures and the mechanisms that regulate community
composition dynamic and cell dispersion in aquatic environments.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche
URI: http://hdl.handle.net/2067/2526
Appears in Collections:Archivio delle tesi di dottorato di ricerca

Files in This Item:
File Description SizeFormat
glupini_tesid.pdf3.33 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

1
Last Week
0
Last month
1
checked on Nov 29, 2020

Download(s)

3
checked on Nov 29, 2020

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.