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Title: Composti di origine naturale e xenobiotici, caratterizzazione chimica, valutazione dell'attività biologica su linee cellulari e potenziali utilizzi chemioterapici
Other Titles: Natural and xenobiotic compounds, chemical characterization, evaluation of biological activity in human cell lines and potential uses as drugs
Authors: Triggiani, Doriana
Keywords: Organostagno;Cellule tumorali;Sostanze naturali;Acetilcolinesterasi;Organotin;Cancer cells;Natural compounds;Acetylcholinesterase;BIO/01
Issue Date: 28-Feb-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
I prodotti naturali ottenuti dalle piante e da altri organismi biologici hanno costituito una continua fonte per l’ottenimento di farmaci. Da uno studio recente è emerso che, di 847 molecole divenute farmaci, il 5% è costituito da prodotti naturali, il 27% da derivati di prodotti naturali e le rimanenti 572 sono molecole sintetiche; di quest’ultime inoltre, 262 possono essere considerate analoghi di prodotti naturali (Newman e Cragg 2007). È interessante sottolineare che i dati riportati non comprendono prodotti biologici e i vaccini che per definizione provengono dalla natura. Si definisce, inoltre, con il termine "xenobiotico" una molecola di qualsiasi tipo, di origine naturale o sintetica, estranea ad un organismo e che può esplicare sia la funzione di farmaco che di veleno tossico.
La ricerca svolta nell’ambito del Dottorato si è posta come obiettivo lo studio di composti di origine naturale e xenobiotici mediante la loro caratterizzazione chimica, la valutazione dell'attività biologica e lo studio dei loro potenziali utilizzi come chemioterapici.
In particolare, l’attività di ricerca si può così riassumere:
A) Identificazione e caratterizzazione di composti biologicamente attivi estratti da Rubus ulmifolius.
B) Valutazione e analisi della chimica biologica dei composti organostagno(OT).
A) Identificazione e caratterizzazione di composti biologicamente attivi estratti da Rubus ulmifolius
Il Rubus ulmifolius Schott è una pianta perenne ampiamente diffusa in Italia e nota come "Rovo" (Pignatti 1982). La pianta di rovo contiene triterpeni, acidi grassi, tannini, flavonoidi (Panizzi et al. 2001) e altre molecole aventi proprietà farmaceutiche non ancora completamente studiate.
La ricerca è stata così condotta.
In una prima fase è stata indagata in vitro l’attività biologica, citotossica e/o antiproliferativa, dell’estratto alcolico, con particolare attenzione agli effetti sulla proliferazione cellulare e alle modificazioni morfologiche e ultrastrutturali.
L’effetto dell’estratto di Rubus ulmifolius è stato valutato sulle linee cellulari tumorali mane HeLa, HepG2, HL60 e HL60/MX2 .
Al fine di evidenziare eventuali effetti antiproliferativi o citotossici, inizialmente sono state valutate le conte cellulari e le curve di crescita in seguito a trattamento con estratto di Rovo. Successivamente sono state applicate tecniche di microscopia al fine di verificare le alterazioni a livello morfologico, citoscheletrico e di espressione proteica imputabili al trattamento con l'estratto.
Studi successivi, condotti per mezzo di cromatografia su strato sottile (TLC) hanno permesso di isolare tra tutti uno spot denominato “R”, la cui azione biologica è sembrata essere più elevata.
Sono state poi effettuate analisi chimiche atte ad individuare la natura del o dei singoli principi attivi presenti nell'estratto di foglie di Rubus ulmifolius ed in particolare nello spot più attivo.
Considerando la struttura chimica dei composti attivi individuati, i quali evidenziano una analogia strutturale con i composti in grado di inibire l’attività dell’enzima acetilcolinesterasi, si è proceduto con l'effettuazione di test di inibizione del suddetto enzima.
I risultati ottenuti permettono di affermare che all’interno delle foglie di rovo esistono molecole di potenziale interesse farmacologico. E’ da evidenziare come l’intensa attività di inibizione della proliferazione cellulare e dell’attività dell’enzima acetilcolinesterasi degli estratti di foglie di R. ulmifolius sia ascrivibile non tanto alle molecole già molto studiate, i flavonoidi quercetina e kamferolo, quanto, e soprattutto, ai loro derivati glucoronici.
B) Valutazione e analisi della chimica biologica dei composti organostagno I composti organostagno (OT) sono composti xenobiotici ubiquitari nell'ambiente. Essi rappresentano gli inquinanti noti più tossici per la vita acquatica; l'inquinamento ambientale da composti OT si è esteso notevolmente a seguito delle ampie applicazioni industriali e agricole. Alcuni composti OT hanno mostrato un effetto anti-neoplastico mentre altri sono risultati citotossici, genotossici, mutageni e neurotossici. Nonostante sia noto il sito di interazione dei composti OT a livello della membrana mitocondriale, i meccanismi di tossicità e di degradazione biologica rimangono poco chiari (Tobin et al. 1999). Studi precedenti hanno dimostrato che un peptide sintetico (SNN-PEP, I1LGCWCYLR9), derivato dalla sequenza primaria della stannina (SNN), proteina coivolta nei processi di detossificazione da composti organostagno e contenente due residui di cisteina vicinali (motivo CXC), è in grado di dealchilare il trimetilstagno a dimetilstagno.
Partendo da tali presupposti, sono stati condotti studi con lo scopo di verificare se il SNN-peptide fosse in grado di dealchilare anche i composti organostagno tetra sostituiti a specie dialchilate, modificandone conseguentemente la citotossicità e l’attività biologica.
È stata quindi studiata la cinetica di dealchilazione del TetraMT (o 4MT, tetrametilstagno) e di due tra i più comuni OT trisostituiti, TMT (cloruro di trimetilstagno) e TET (bromuro di trietilstagno) mediante spettroscopia di fluorescenza. Il meccanismo di reazione è stato razionalizzato attraverso una reazione pseudoenzimatica che termina in un complesso costituito dalla specie di-alchilata e SNN-PEP legati covalentemente.
Poiché i composti tetra- e i tri-alchilstagno mostrano un marcato ritardo nella loro azione tossica rispetto ai corrispondenti analoghi di-e mono-alchilati, è stato ipotizzato che la tossicità ritardata sia una conseguenza della dealchilazione progressiva dei composti OT con produzione di di-e mono-derivati più tossici, che legano e interagiscono con gli enzimi e le proteine coinvolte nella detossificazione.
In studi precedenti è stato inoltre ipotizzato che i composti organo stagno, interagendo con la stannina o direttamente con il DNA, possano avviare una cascata di eventi atti ad indurre la morte cellulare o a controllare l’espressione e la sintesi della stannina stessa.
È stata quindi studiata l’attività biologica dei diversi composti organostagno utilizzando come modelli cellulari le linee HeLa e NB2a sulle quali sono stati condotti saggi MTT, analisi morfologiche (microscopia ottica) e citoscheletriche (microscopia a fluorescenza). I composti organostagno usati nei trattamenti sono stati i seguenti: cloruro di trifenilstagno (TPT), tetrametilstagno (4MT) ed in particolare dicloruro di dimetilstagno (DMT), cloruro di trimetilstagno (TMT), bromuro di trietilstagno (TET), alle concentrazioni comprese tra 1 e 100μM.
Indagini in vitro, per verificare eventuali modificazioni nell’espressione della SNN in seguito al trattamento delle cellule Hela (adenocarcinoma della cervice umana) e NB2a (neuroblastoma murino) con concentrazioni crescenti di tre composti organo stagno DMT, TMT e TET, sono state effettuate mediante immunofluorescenza.

Natural products derived from plants and other biological organisms are a continuous source for new drugs. A recent study shows that of 847 drug molecules, 5% are natural products, about 27% derives from natural products and the remaining 572 are synthetic molecules (Newman and Cragg 2007), of which 262 can be considered analogous to natural products. It is interesting to note that these dates do not include biological products and vaccines, which by definition come from nature.
It’ s called “xenobiotic” any type of molecule, having natural or synthetic origin, foreign to
an organism, that can exert the function both of drug than toxic poison.
The research activity,during the PhD, was pointed out on the study of natural and xenobiotic compounds, their chemical characterization, evaluation of biological activity and consequently their potential uses as drugs. The researches were focused on two different topics:
A) Identification and characterization of biologically active compounds from Rubus ulmifolius extracts.
B) Evaluation and elucidation of the biological chemistry of organotin compounds.
A) Identification and characterization of biologically active compounds from Rubus ulmifolius extracts
Rubus ulmifolius Schott is a perennial plant widely diffused in Italy and well known as “rovo” (Pignatti 1982). Rubus leaf extract contains triterpenes, fatty acids, tannins, flavonoids (Panizzi et al. 2001) and other molecules having pharmaceutical properties not completely studied. Outline. First, we investigated the biological activity (cytotoxic or antiproliferative) of alcoholic extract, with particular attention to the effects on cell proliferation and morphological changes.
The evaluation of the effect of Rubus ulmifolius extract was evaluated on human tumor cell lines HeLa, HepG2, HL60 and HL60/MX2.
In order to detect the cytotoxic or antiproliferative effects, we evaluated the cell countings and the growth curves upon treatment with different extracts..
Subsequently, the morphological and cytoskeletal alterations at cellular level were studied by microscopy techniques.
Further, by thin layer chromatography (TLC) we isolated a spot, named "R", showing the highest biological activity.
Then we identified the molecules contained in the active spot from Rubus ulmifolius leaves extract.
On the basis of these results and seen the similarity between the chemical structure of the molecules identified and tacrine, an inhibitor of the acetylcholinesterase previously studied in our lab, we tested these compounds as inhibitors of acetylcholinesterase.
The results obtained suggest that molecules from spot “R” have some pharmacological interest.
Interestingly the inhibition activity of R. ulmifolius extracts on cell proliferation and on Acetylcholinesterase is not only due to the molecules already known and studied, the flavonoids quercetin and kaempferol, but also to their glucuronide derivatives.
B) Evaluation and elucidation of the biological chemistry of organotin compounds.
Organotin compounds are xenobiotic compounds ubiquitous in the environment. They represent the most toxic pollutants known for aquatic life; environmental pollution caused by OT compounds extended widely as a result of large industrial and agricultural applications. Some OT compounds showed an anti-neoplastic action while others were cytotoxic, genotoxic, mutagenic and neurotoxic.
Although the site of interaction of the OT compounds, at mitochondrial membrane level, is well known, the mechanisms of toxicity and biological degradation remain unclear (Tobin et al. 1999). Previous studies have shown that a synthetic peptide (SNN-PEP, I1LGCWCYLR9), derived from the primary sequence of stannin, a protein involved in the detoxification of OT, and containing two vicinal cysteine residues (CXC motif), is able to dealkylate TMT to DMT suggesting that this reaction is also involved in triggering of cell death by apoptosis.
Starting from this point, studies were conducted with the aim of verified whether the SNN-peptide was able to dealkylate organotin compounds in species less substituted, thus altering their cytotoxicity and biological activity.
Therefore, we investigated the kinetics of the dealkylation TetraMT and two of the most common OT trisubstituted, TMT and TET by fluorescence spectroscopy,. The reaction mechanism cna be described as a pseudoenzymatic reaction that ends in a covalent complex formed by the di-alkyltin compound bound to SNN-PEP.
Tetra-and tri-alkyltin compounds show a marked delay in their toxic action when compared with the corresponding molecules di- and mono-alkylated. So, it was hypothesized that the delayed
toxicity is a consequence of progressive dealkylation of compounds with production of more toxic di- and mono-derivatives.
In previous studies it was suggested that organotin compounds, interacting with stannin or directly with the DNA, could initiate a cascade of events necessary to induce cell death or else, to control the stannin expression . Thus we study the biological activity of different organotin compounds on two cell lines: HeLa and NB2a by MTT assays, morphological analysis (light microscopy) and cytoskeletal observations (fluorescence microscopy). Organotin compounds used in treatments were: Triphenyltin chloride (TPT), Tetramethyltin (4MT), in particular Dimethyltin dichloride (DMT), Trimethyltin chloride (TMT), Triethyltin bromide (TET) at the concentrations ranging from 1 to 100 μM .
Investigations by immunofluorescence were carried out to verify changes in the SNN expression after treatment of Hela (human cervical adenocarcinoma) and NB2a cells (murine neuroblastoma) with increasing concentrations of DMT, TMT and TET.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2509
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