Development of a novel set of microsatellite markers and genetic characterization of Italian natural Tamarix populations

Abstract

Tamarix plants are characterized by tolerance to extreme environmental conditions and represent an alternative resource for the recovery of marginal areas. However, their taxonomy is troublesome, and few molecular markers are available to enable species identification. Transcriptome sequencing projects offer a potential source for the development of new markers, named EST-SSRs. Thirteen polymorphic simple sequence repeat (SSRs) markers derived from Expressed Sequence Tags (ESTs) from Tamarix hispida, T. androssowii, T. ramosissima, and T. albiflonum were identified and screened on 24 samples of T. africana to detect polymorphism. The number of alleles per locus ranged from two to eight, with an average of 4.3 alleles per locus, and the mean expected heterozygosity was 0.453. Amplification products of these 13 loci were also generated for T. gallica. Tamarix plants were collected in seven sites from Italian islands, Central and Southern Italy: Imera, Simeto and Alcantara from Sicily, Crati from Calabria, Basento from Basilicata, Baratz from Sardinia, and Marangone from Lazio. It was performed a blind sampling, thus individuals were collected without any regard for species identity. Indeed, despite during our germplasm collection flowers for species identification were collected; a large set of samples remained unidentified. The number of individuals surveyed for site ranges from 24 to 84, with a total of 316 plants. The identities of 85 plants were determined with Baum’s morphological keys, while all the rest (72% of the total) remained unidentified. An assignment method based on the use of molecular markers with a Bayesian statistical approach allowed the identification of individuals among species. It was found a clear assignment of T. africana individuals. Otherwise, it was not the same for T. gallica and T. canariensis, whose individuals were assembled together in a unique genetically homogeneous group (T. gallica-like), consistent with the hypothesis of introgression between species. Starting from a total of 221 unidentified plants the Bayesian approach assigned 142 individuals to T. africana, 78 to the T. gallica-like group, while 11 individuals (3.49%) were considered admixed and discarded for further analysis. The advantage concerning the use of molecular markers for classification purposes is that they can be used to assess differentiation across a wide range of taxonomic levels and address questions of species status by comparing inter-intra taxa differentiation. Thus, a high assignment power panel could be employed not only in the species studied in the present work, but could represent a new, fast and cheap method for species identification in all the taxa belonging to the genus Tamarix. It is noteworthy that only two loci, T1B8 and Ta1350, were required to achieve assignment to the species. Three sites resulted monospecific stands of T. africana (Alcantara, Baratz, and Marangone), four stands resulted mixed with T. africana and T. gallica-like group contemporarily present in the same site (Crati, Imera Basento, and Simeto), while no any monospecific composition of T. gallica-like was found. The analyses of genetic structure of these populations pointed out the existence of a unique gene pool in Southern Italy for both T. africana and T. gallica-like, with populations characterized by low variability. On the other hand, T. africana populations from Central Italy and Sardinia resulted more differentiated, despite the Mantel test for isolation by Terzoli: Development of a novel set of microsatellite markers and genetic characterization of Italian natural Tamarix populations distance was not significant. It means that probably the genetic variability is affected by environmental factors, but it is not clear yet which features are involved. At the best of our knowledge the present work is the first one regarding the characterization of genetic resources in Italian tamarisks.

Le tamerici sono caratterizzate da una elevate tolleranza a condizioni ambientali estreme e rappresentano una potenziale risorsa per il recupero delle aree marginali. Tuttavia, la tassonomia del genere Tamarix è problematica ed esistono pochi marcatori molecolari che possano essere utilizzati per l’identificazione delle specie. I progetti di sequenziamento del trascrittoma offrono, tuttavia, una risorsa per lo sviluppo di nuovi marcatori. Sono stati sviluppati 13 nuovi marcatori microsatellite derivati da sequenze espresse (EST) di Tamarix hispida, T. androssowii, T. ramosissima e T. albiflonum. Questi marcatori sono stati testati su 24 individui di T. africana per evidenziarne il polimorfismo. Il numero di alleli per locus varia da due a otto con una media di 4.3 alleli per locus, mentre l' eterozigosi attesa media è pari a 0.453. L’amplificazione di questi 13 loci è stata inoltre verificata in T. gallica. Le tamerici sono state raccolte in sette siti localizzati nelle isole e nell'Italia centrale e meridionale: Imera, Simeto e Alcantara dalla Sicilia, Crati dalla Calabria, Basento dalla Basilicata, Baratz dalla Sardegna e Marangone dal Lazio. È stato condotto un campionamento alla cieca in cui le piante sono state raccolte senza nessuno riguardo per l'identità specifica. Infatti, sebbene durante la collezione del germoplasma Italiano siano stati raccolti i fiori per l’identificazione specifica, non si è pervenuti all’identificazione di molti campioni. Il numero di individui collezionati per sito varia da 24 a 84 per un totale di 316 tamerici. È stata determinata l'identità specifica di 85 piante utilizzando la chiave morfologica di Baum, mentre le rimanenti piante (72%) sono state considerate indeterminate. L'identificazione specifica degli individui indeterminati è stata realizzata mediante un metodo di assegnazione basato sull'utilizzo di marcatori microsatelliti ed un approccio statistico di tipo Bayesiano. Gli individui della specie T. africana hanno presentato un chiara assegnazione. Mentre, non è stato ottenuto lo stesso risultato per le specie T. gallica e T. canariensis i cui individui hanno formato un unico gruppo omogeneo dal punto di vista genetico (T. gallica-like), coerente con l’ipotesi di introgressione tra le specie. Complessivamente gli individui indeterminati erano 221, il metodo Bayesiano ha asseganto 142 individui alla specie T. africana, 78 al gruppo ascrivibile a T. gallica, mentre 11 individui (3.49% del totale) non sono stati assegnati e quindi sono stati scartati dalle analisi successive. Il vantaggio dell'utilizzo dei marcatori molecolari negli studi di classificazione che questi possono essere utilizzati per evidenziare la differenziazione a diversi livelli tassonomici, e possono chiarire lo status delle specie comparando la differenziazione all'interno e tra taxa. Un gruppo di marcatori caratterizzati da un alto livello di confidenza nell'identificazione specifica potrebbe essere utilizzato non soltanto nelle specie studiate nel presente lavoro, ma potrebbe rappresentare un nuovo metodo, poco costoso, riproducibile e veloce per l'identificazione delle specie appartenenti al genere Tamarix. È da sottolineare che i nostri risultati hanno evidenziato che per ottenere l'identificazione specifica sono sufficienti due loci, T1B8 e Ta1350. Tre siti sono risultati essere formazioni monospecifiche di T. africana (Alcantara, Baratz, e Marangone), quattro popolamenti sono misti con la contemporanea presenza di T. africana e del gruppo ascrivibile a T. gallica (Crati, Imera Basento, e Simeto), mentre non sono state riscontrate formazioni monospecifiche del gruppo ascrivibile a T. gallica. L’analisi della struttura genetica delle popolazioni ha evidenziato l’esistenza di un unico pool genico Terzoli: Development of a novel set of microsatellite markers and genetic characterization of Italian natural Tamarix populations presente nelle regioni del meridione d’Italia per entrambe le specie, con popolazioni caratterizzate da una bassa variabilità genetica. D’altro canto, le popolazioni di T. africana provenienti dall’Italia centrale e dalla Sardegna appaiono differenziate rispetto alle altre, nonostante il test di Mantel per l’isolamento per distanza non sia risultato significativo. Ciò significa che presumibilmente la variabilità genetica è affetta da parametri ambientali che tuttavia ancora non sono stati definiti. Al meglio della nostra conoscenza, il presente lavoro è il primo riguardante la caratterizzazione delle risorse genetiche del genere Tamarix in Italia.