Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2501
Title: Positional cloning of the parthenocarpic fruit (pat) mutant gene and identification of new parthenocarpic sources in tomato (Solanum lycopersicum, L.)
Authors: Selleri, Luigi
Keywords: Pat-1;Positional cloning;Parthenocarpic;Solanum lycopersicum;AGR/07
Issue Date: 21-Mar-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 22. ciclo
Abstract: 
In this work we characterized two parthenocarpic sources in tomato by positionally
cloning the gene responsible of the parthenocarpic fruit (pat) phenotype and by TILLING
the SlIAA9 gene, a major member of the ovary repressor machinery before pollination.
The importance of parthenocarpic mutations is due to their possible use in breeding
programs, as well as in studies aimed to the comprehension of mechanisms underlying the
fruit set. An understanding of the molecular events underlying parthenocarpy, in fact,
would provide information on factors regulating fruit and seed formation, and thus open
new perspectives for yield improvements by biotechnological means.
The pat mutation (Bianchi and Soressi, 1969), induces parthenocarpy with strong
expressivity along with other pleiotropic effects such as short anthers and aberrant ovules
(Mazzucato et al., 1998). Through Bulk Segregant Analysis the Pat gene was mapped, by
using two segregating populations, on the long arm of chromosome 3 between two
conserved ortholog set (COS) markers (COSes; Fulton et al., 2002), T0796 and T1143
(Beraldi et al., 2004), previously anchored on the genetic tomato map (EXPEN 2000,
www.sgn.cornell.edu).
We developed and mapped novel PCR-derived COS markers inside the target window for
the Pat gene by pursuing the microsynteny between tomato and Arabidopsis (Fulton et al.,
2002). Through genetic and physical mapping, the genetic region spanning 1.2 cM
between COSes T0796 and T1143, was refined with new anchor-points and the target
interval for the Pat locus was restricted to less than 0.2 cM between markers named T17
and T20. The small size of the new target region and the recent publication of the tomato
genome sequence (SGN, www.sgn.cornell.edu) allowed us to carry out a candidate gene
approach with the aim to clone the gene responsible for the pat phenotype. Four of the
nine potential candidate genes mapping in the T17-T20 genomic window, were amplified
and sequenced from WT (Chico III) and pat lines. A point mutation in the SlHB15 gene, a
transcriptor factor belonging to the HD-Zip III family, was found and proposed as
responsible for the pat phenotype. In order to confirm this hypothesis a complementation
experiment with the HB15 WT gene will be necessary. HD-Zip III and KANADI, two
antagonistic gene families, were included in a new model that would explain the pat
phenotype and the molecular pathway that triggers the fruit set.
Abstract
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In the second part of this work, a TILLING approach has been undertaken in order
to identify tomato genotypes carrying mutations in the SlIAA9 coding sequence. As
demonstrated in recent publications, TILLING shows promise as a non-transgenic tool to
improve domesticated crops by introducing and identifying novel genetic variation in genes
that affect key traits. SlIAA9, a member of the Aux/IAA family of transcription factors in
tomato, has been described as playing a major role in the ovary repressor machinery and
plants silenced by antisense showed several IAA-related developmental defects and a
parthenocarpic behavior (Wang et al., 2005). The analysis of M3 families yielded three
lines carrying a genetic lesion in the coding sequence of SlIAA9, two showing a point
mutation leading to amino acidic substitution and the third showing a single-base deletion
leading to a frame-shift and a premature stop codon. Characterization of the former lines,
showed some of the expected phenotypes, albeit with low penetrance and expressivity
(occurrence of polycots, abnormal growth of axillary shoots, low number of seeds per fruit
or seedlessness). Characterization of the latter line showed severe phenotypes, in
agreement with those expected, that mainly consisted in an obvious loss of leaf
compoundness and parthenocarpy. This observation suggest the interest of this line in
studying the role of the IAA9 transcription factor in reproductive development, although its
partial sterility may hamper its employment in breeding parthenocarpic tomato varieties.

In questo lavoro sono state caratterizzate due fonti di partenocarpia in pomodoro
attraverso il clonaggio per mappatura del gene responsabile del fenotipo del mutante
partenocarpic fruit-1 (pat) e attraverso il TILLING del gene SlIAA9, uno dei principali
membri del sistema di repressione dell’ovario prima dell’impollinazione.
L’importanza delle mutazioni di partenocarpia è dovuta al loro possibile ruolo nei
programmi di breeding ma anche in studi il cui scopo è quello di comprendere i
meccanismi molecolari che portano alla formazione del frutto. Infatti, la comprensione dei
meccanismi molecolari che inducono la partenocarpia fornirebbe informazioni anche sui
fattori che regolano la formazione del seme e del frutto, e così aprirebbe nuove prospettive
per il miglioramento genetico attraverso mezzi biotecnologici.
La mutazione pat (Bianchi and Soressi, 1969) induce partenocarpia con forte
espressività ma causa anche altri effetti pleiotropici quali la formazione di antere corte e
Abstract
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ovuli aberranti (Mazzucato et al., 1998). Attraverso l’analisi dei gruppi segreganti (BSA) il
locus Pat è stato precedentemente mappato sul braccio lungo del cromosoma 3 di
pomodoro tra due marcatori ortologhi conservati (COS; Fulton et al., 2002), T0796 e
T1143 (Beraldi et al., 2004), ancorati sulla mappa genetica pubblicata all’SGN (Sol
Geomics Network; EXPEN 2000, www.sgn.cornell.edu).
In questo studio, tramite l’utilizzo della microsintenia tra Arabidopsis e pomodoro (Fulton et
al., 2002), sono stati sviluppati e mappati all’interno della regione target per il gene Pat
nuovi marcatori COS PCR-derivati. Attraverso un lavoro di mappatura genetica e fisica, la
regione genetica di 1,2 cM, tra i marcatori T0796 e T1143, è stata rifinita con nuovi
marcatori e la regione target per il locus Pat è stata ristretta a circa 0,2 cM, tra due
marcatori denominati T17 e T20. Le ridotte dimensioni della nuova regione e la recente
pubblicazione del genoma di pomodoro (SGN; www.sgn.cornell.edu) hanno quindi
permesso di attuare l’analisi di potenziali geni candidati al fine di isolare quello
responsabile del fenotipo pat. Quattro di nove geni, localizzati nella regione genomica tra i
marcatori T17 e T20, sono stati sequenziati nella linea pat e nel corrispettivo WT (Chico
III). In questo modo, una mutazione puntiforme sul gene SlHB15, un fattore di trascrizione
appartenente alla famiglia genica HD-Zip III, è stata identificata e proposta come
responsabile del fenotipo pat. Al fine di confermare questa ipotesi, sarà necessario un
esperimento di complementazione con il gene HB15 WT sulla linea pat. Due famiglie
geniche antagoniste, HD-Zip III e KANADI, sono state incluse in un nuovo modello che
spiegherebbe il fenotipo pat e il pathway molecolare che porta alla allegagione del frutto.
Nella seconda parte di questo lavoro, al fine di identificare nuove fonti di
partenocarpia in pomodoro, il gene SlIAA9 è stato saggiato su due popolazioni di TILLING
(cultivar Red Setter; Minoia et al., 2010) disponibili presso l’ Istituto di Ricerca Metapontum
Agrobios. Infatti, come recentemente dimostrato in diverse pubblicazioni, il TILLING può
rappresentare una metodologia che non ricorre al transgenico per migliorare le specie di
interesse agrario attraverso l’induzione e l’identificazione di nuove forme alleliche in geni
che controllano tratti chiave per il miglioramento genetico. Il gene SlIAA9, un membro della
famiglia di fattori di trascrizione Aux/IAA in pomodoro, è uno dei componenti chiave del
complesso molecolare responsabile della repressione dell’ovario prima dell’impollinazione;
il silenziamento di questo gene provoca difetti di sviluppo correlati all’ IAA e la formazione
di frutti partenocarpici (Wang et al., 2005). L’analisi di circa 5000 famiglie M3 ha portato
all’identificazione di tre linee con una lesione sulla sequenza codificante il gene SlIAA9:
due di esse mostrano una mutazione puntiforme che causa una sostituzione
Abstract
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amminoacidica, la terza mostra una delezione di una base che causa un errore di lettura
ed un prematuro codon di stop.
La caratterizzazione delle prime due linee ha mostrato alcuni dei tratti fenotipici attesi,
anche se con bassa penetranza ed espressività (formazione di più cotiledoni, crescita
anormale di germogli ascellari, basso numero o assenza di semi nel frutto).
La caratterizzazione della terza linea ha mostrato caratteri fenotipici più forti, in accordo
con quelli attesi, che consistono soprattutto in una perdita di complessità delle foglie e
partenocarpia. Queste osservazioni mettono in risalto l’interesse di questa linea nello
studio del ruolo che il fattore di trascrizione IAA9 ha nello sviluppo riproduttivo; la sua
maggiore caratterizzazione relativa alla capacità di produrre frutti e semi ne indicherà le
prospettive reali di utilizzo nel miglioramento genetico di pomodoro.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2501
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