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Title: Processi microevolutivi e genesi degli hotspot di biodiversità intraspecifica
Other Titles: Microevolutionary processes and formation of hotspots of intraspecific biodiversity
Authors: Sacco, Florinda
Keywords: Anfibi;Diversità genetica;Rifugi glaciali;Amphibians;Genetic diversity;Glacial refugia;BIO/07
Issue Date: 10-Feb-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 22. ciclo
Abstract: 
Le penisole del Mediterraneo e in particolare la loro porzione meridionale, sono hotspot di
biodiversità sia a livello di specie che a livello intraspecifico. Tale caratteristica le rende degli ottimi
laboratori naturali per studi volti a far luce sulle dinamiche microevolutive che determinano la
distribuzione geografica della diversità genetica e la genesi degli hotspot di biodiversità intraspecifica.
La ricchezza in diversità genetica intraspecifica è stata messa in relazione con il ruolo di rifugio
svolto da queste aree per le specie temperate durante le severe oscillazioni climatiche del Pleistocene.
Uno scenario proposto per spiegare tale relazione descrive queste aree come storiche aree depositarie
della variabilità genetica intraspecifica, che grazie a condizioni ambientali favorevoli, avrebbero offerto
a specie temperate le condizioni per la persistenza di grandi e stabili popolazioni. Secondo un altro
scenario, denominato “refugia-within-refugia”, l’alta variabilità nelle aree presunte di rifugio sarebbe
invece da attribuire a processi microevolutivi che avrebbero portato ad un incremento della diversità
genetica, come la frammentazione allopatrica, eventualmente seguita da fenomeni di contatto
secondario.
Nel presente lavoro è stata analizzata la variazione geografica di tre specie di anfibi, Salamandra
salamandra, Lissotriton italicus e Rana dalmatina, con lo scopo di indagare se e in che misura i due scenari
evolutivi poc’anzi descritti possano avere influenzato la storia delle popolazioni di queste specie. I
risultati dei singoli studi sono stati poi confrontati per poter rilevare le eventuali linee di concordanza e
di discordanza, al fine di poter rilevare aspetti di validità generale su i principali processi microevolutivi
implicati nella formazione di un hotspot di biodiversità intraspecifica.
La variazione genetica in popolazioni italiane di S. salamandra è stata studiata attraverso l’analisi
di marcatori sia nucleari (23 loci allozimici) sia mitocondriali (Cyt-b, 582bp). Le due classi di marcatori
sebbene concordino nell’indicare una forte strutturazione geografica della variazione genetica,
discordano sonoramente nella descrizione della collocazione della principale discontinuità filogeografica
osservata. Tale discordanza suggerisce un contatto secondario tra le due sottospecie, S. s. salamandra e S.
s. giglioli, in seguito al quale si sarebbe verificato un fenomeno di ibridazione introgressiva differenziale
ai diversi loci. Sette loci allozimici diagnostici suggeriscono l’Appennino ligure come la sede di tale
evento, cui avrebbe fatto seguito una massiccia introgressione selettivamente favorita della forma
mitocondriale della sottospecie nominale nelle popolazioni della sottospecie S. s. giglioli, tale da
soppiantare completamente la forma mitocondriale tipica della giglioli fino alla piana del Volturno, area
emersa come la sede di transizione tra il gruppo meridionale e settentrionale di S. salamandra gigliolii.
L’area presso l’Appennino ligure e quello settentrionale è risultata essere la sede dell’hotspot di diversità
genetica della S. salamandra in Italia. L’origine di questo hotspot può essere attribuita a processi di
frammentazione e ibridazione introgressiva.
La variazione genetica nelle popolazioni di L. italicus è stata indagata attraverso l’analisi di
1897bp ottenute dall’amplificazione di due frammenti del mtDNA (ND2 e ND4) su campioni
provenienti da 22 località rappresentative di tutto il suo areale. Tale analisi ha rilevato un pattern di
diversità estremamente complesso, al di là di ogni previsione rispetto ai dati nucleari (loci allozimici)
presenti in letteratura sul tritone italiano. Sono stati infatti individuati 2 linee evolutive principali,
estremamente differenziate l'una dall'altra (6,8%), con distribuzione parapatrica, una delle quali è
ristretta alla Calabria centro meridionale, mentre l’altra è invece diffusa nel resto dell’areale. Ciascuna
linea è risultata ulteriormente suddivisa, e nel complesso si evidenziano 8 cladi terminali, 5 dei quali
collocati in Calabria. Tale pattern suggerisce che le popolazioni del tritone italiano siano andate
incontro a ripetuti cicli di frammentazione allopatica attraverso il Plio-Pleistocene, ed in particolare che
durante l'ultima fase glaciale del Pleistocene si siano frammentate in otto rifugi. Le differenze osservate
tra il pattern di diversità genetica osservato a livello del mtDNA e quello allozimico sono dovute ad un
campionamento limitato della Calabria nel lavoro precedente, proprio dell’area emersa come hotspot di
diversità e sede di rifugi multipli per il tritone italiano.
La variazione genetica in Rana dalmatina è stata studiata attraverso l’analisi di un frammento del
mtDNA (16S; 421bp) in individui campionati in 22 località dell’Italia, della Croazia e della Slovenia e
con sequenze di individui della Spagna, Germania e Moldavia presenti in GenBank. I nostri risultati
hanno individuato una variabilità genetica più alta tra le popolazioni italiane della R. dalmatina. La
variazione genetica nelle popolazioni italiane, slovene e croate della R. dalmatina sono state
ulteriormente indagate attraverso l’analisi di altri due frammenti del mtDNA (Cyt-b e COI; 1404 bp) su
campioni provenienti da 40 località. Sono stati individuali due aplogruppi principali ben differenziati
(4,2%), uno comprende aplotipi osservati in popolazioni a nord del margine settentrionale del bacino
idrografico del fiume Volturno, mentre l’altro al sud di tale margine. Ogni aplogruppo è risultato
ulteriormente suddiviso. Complessivamente, si evidenzia un pattern della diversità genetica
geograficamente strutturato. Inoltre, la penisola calabrese è emersa come l’hotspot di diversità genetica
intraspecifica della R. dalmatina, infatti qui sono stati osservati non solo uno dei 2 aplogruppi principali
ma anche il 59% degli aplotipi. Sia il pattern filogeografico che l’analisi di demografia storica indicano
che tale pattern è stato determinato principalmente da frammentazione allopatrica, espansione e
contatti secondari.
Complessivamente, nonostante le rispettive peculiarità delle loro storie evolutive, i pattern di
diversità genetica delle tre specie studiate, sono risultati simili tra loro in quanto tutti fortemente
strutturati geograficamente. Confrontando questi pattern sia tra loro che con quello di altre specie è
stato osservata anche un’importante coincidenza spaziale nella locazione delle discontinuità osservate.
Inoltre, anche se le sedi degli hotspot delle tre specie studiate sono risultate diverse, tuttavia i nostri dati
indicano che l’origine di ciascuno di essi sia da attribuirsi principalmente a processi di frammentazione
allopatrica, eventualmente seguite da espansione e da ibridazione introgressiva, e non ad una prolungata
stabilità demografica delle popolazioni. Pattern simili, determinati dagli stessi processi appena descritti,
sono stati documentati anche in altre specie non solo nel sud della penisola italiana, ma anche in specie
di altre regioni del mondo diverse per storia paleogeografiche e/o paleoclimatiche. Pertanto, questi
processi sembrano essere una caratteristica comune nella storia della formazione di un hotspot di
diversità intraspecifica. Infine, le aree dove coincidono le sedi di discontinuità filogeografiche e/o zone
di contatto secondario per più specie dovrebbero essere considerante non solo semplici hotspot di
diversità intraspecifica, ma hotspot evolutivi. L’individuazione di queste aree ci permetterà pertanto di
realizzare l’obiettivo principale della biologia della conservazione: proteggere la biodiversità e i processi
che la generano e la sostengono.

The southern Mediterranean peninsulas are well-known hotspots of biodiversity at both species
and intraspecific level. This characteristic makes them excellent natural laboratories for studies to shed
light on microevolutionary dynamics that determine the geographic distribution of genetic diversity and
the genesis of intraspecific biodiversity hotspots.
The richness in intraspecific genetic diversity has been attributed to the role of refuge played by
these areas for temperate species during the severe climatic oscillations of the Pleistocene. One
proposed scenario describes these areas as historical repositories of genetic variability for many
temperate species, given that they offered the possibility for the long-term persistence of large and
demographically stable populations. According to another scenario, known as “refugia within refugia”,
high variability in areas of putative refuge would instead be attributed to microevolutionary processes
that would lead to an increase in genetic diversity, such as allopatric fragmentation, possibly followed
by secondary contacts.
In this study we investigated the geographic variation of three species of amphibians, Salamandra
salamandra, Lissotriton italicus and Rana dalmatina, with the aim of investigating whether and to what
extent the two evolutionary scenarios described above may have influenced the history of populations
of these species. The results of the individual studies were then compared, to individuate lines of
concordance and/or divergence, in order to detect aspects of general validity for the microevolutionary
processes most involved in determining the formation of a hotspot of intraspecific biodiversity.
Genetic variation in the Italian populations of S. salamandra was investigated using both nuclear
(23 allozyme loci) and mitochondrial markers. Although the two classes of markers both showed a
geographically structured pattern of genetic diversity, they disagree strongly regarding the location of
the main phylogeographic discontinuity observed. This discrepancy indicates a secondary contact
between the two subspecies S.s. salamandra and S. s. giglioli, owing to an event of differential
introgresseve hybridization at different loci. Seven allozyme loci suggest the Ligurian Apennines as the
area of secondary contact. There subsequently took place a selectively favoured introgression of the S.
s. salamandra’ mitochondrial form into the S. s. giglioli. This introgression replaced the S. s. giglioli’
mitochondrial form completely as far as the Volturno basin, the phylogeographical break for the
southern and northern groups of S. salamandra gigliolii. Overall, the hotspot of genetic diversity of Italian
S. salamandra is located in the Ligurian and Northern Apennines, and its origin can be attributed to a
process of allopatric fragmentation and introgressive hybridization.
Genetic variation in populations of Lissotriton italicus was investigated by analysis of sequences of
two mitochondrial gene fragments (ND2 and ND4; overall 1897bp) of individuals from 23 localities
spanning the entire species range. The analysis revealed a phylogeographical pattern of unexpected
complexity, according to a previous allozyme survey of variation. Indeed, our data provided evidence of
two strongly divergent lineages (6,8%), which had a parapatric distribution, one restricted to part of the
Calabrian peninsula, the other widespread throughout the rest of the species range. Both lineages are
further subdivided, giving a total of eight terminal haplogroups, five of which are found in Calabria.
This pattern suggests that the species underwent repeated cycles of allopatric fragmentation throughout
the Plio-Pleistocene; in particular, during the Late Pleistocene glacial cycle the Italian newt was
fragmented into eight refugia. The discrepancy between our data and a previous allozyme survey of
variation is due to the former study’s incomplete sampling in Calabria, in the exact area that was
subsequently identified as multiple refugia for the Italian newt.
Genetic variation in populations of Rana dalmatina was first investigated by analysis of
sequences of one mitochondrial gene fragment (16S; 421 bp) of individuals sampled in 22 localities
from Italy, Slovenia and Croatia, along with individual from Spain, Germany and Moldavia taken from
a GenBank. Our results provided evidence that the highest level of genetic diversity of R. dalmatina is
located in Italy. Genetic variation in Italian, Croatian and Slovenian populations of the agile frog was
further analysed using two other mitochondrial gene fragments (Cyt-b and COI; overall 1404 bp) of
individuals from forty localities. Two divergent haplogroups were identified (4,2%), one found in the
population located above and the other below the northern edge of the Volturno river’s plain. Both
haplogroups are further subdivided into other haplogroups. Overall, our data showed a geographically
structured pattern of genetic diversity. The Calabrian peninsula proved to be the hotspot of
intraspecific diversity for R. dalmatina, as one principal haplogroup and 59% of haplotypes were found
there. Both phylogeographical and historical demographical analysis suggested that the pattern of
genetic diversity was principally shaped by allopatric fragmentation in multiple refugia, followed by
expansion and then by secondary contact.
Overall, despite the peculiarities of their evolutionary histories, patterns of genetic diversity of
the three species studied were similar to each other, since all showed a highly structured geographical
pattern. Comparing these patterns, important spatial coincidences in the main locations of phylogenetic
discontinuity were also identified. Although the locations of their hotspots were different, the origin of
each hotspot was determined by allopatric fragmentation, possibly followed by expansion and
introgressive hybridization and not by demographic stability of large populations. Similar patterns,
determined by the same processes as described above, have been documented in other species not only
in the south of the Italian peninsula, but also in species from other regions of the world with different
paleogeographic and/or paleoclimatic history. Therefore, these processes are probably the common
feature in the history of the formation of a hotspot of intraspecific diversity.
Finally, those areas where we found phylogeographic discontinuity and/or contact zones should
for many species not be regarded as simple hotspots of intraspecific diversity, but as evolutionary
hotspots. Identifying such areas will help us realize the fundamental goal of conservation biology:
protecting biodiversity and the processes that generate and sustain it.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche
URI: http://hdl.handle.net/2067/2496
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