Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2491
Title: Isolation and functional characterization of pectin methylesterase inhibitor (PMEI) genesin durum wheat (Triticum durum Desf)
Other Titles: Isolamento e caratterizzazione funzionale di geni inibitori della pectina metilsterasi in frumento duro (Triticum durum Desf)
Authors: Rocchi, Valentina
Keywords: Cell wall;Pectin;PME;PMEI;Transgenic plants;Parete cellulare;Pectina;Piante transgeniche;BIO/04
Issue Date: 22-Mar-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
One of the main goal of breeding programs is the development of crop varieties that simultaneously
control different pathogens. This can be obtained by improving the pre-existing plant defence
mechanisms such as the structure and composition of the plant cell wall, which is one of the first
barriers encountered by the microbial pathogens during plant tissue colonization. To overcome this
obstacle, most fungal pathogens produce a variety of enzymes that degrade the wall polysaccharides;
among them, pectin degrading enzymes are among the first to be secreted by the pathogens to enter
and spread into the plant tissue.
Pectin in the plant cell wall is secreted in a highly methylesterified form and is demethylesterified in
muro by pectin methylesterase (PME). PME activity contributes to modify the structure of pectin,
affecting also the susceptibility to hydrolytic attack of pathogen pectin degrading enzymes. The
activity of PME is regulated by specific interaction with a protein inhibitors (PMEIs). Since the
modification of pectin are associated with important plant physiological processes and also with plant
defence response, the interaction PME-PMEI can have an important biological role.
In wheat, genes encoding for pectin methyelesterase inhibitor have not been characterized, for this
reason during this work three different genes Tdpmei2.1, Tdpmei2.2, Tdpmei7.3 were characterized
from durum wheat cv. Svevo. It has been demonstrated that these genes encode for functional inhibitor
able to reduce the PME activity of Orange peel PME (OpPME). Moreover, the TdPMEI2.1,
TdPMEI2.2 e TdPMEI7.3 are able to inhibit the endogenous wheat PME activity, showing a
specificity against PME activity from different wheat tissues. All the three inhibitors do not show
inhibitory capability against microbial PME.
Tdpmei2.1 e Tdpmei2.2 have been localized on the long arm of chromosome group 2 and their
sequence is strongly conserved in wild wheat progenitors.
To shed light on the possible physiological role of these inhibitors, the transcript accumulation of
Tdpmei2.1, Tdpmei2.2 and Tdpmei7.3 has been investigated. Results show that trascripTdpmei2.2 and
Tdpmei7.3 undergo intron retention. The complete removal of intron of both genes is observed only in
anther tissue. Differently, the Tdpmei7.3 transcript accumulated in all tissue analyzed but strongly in
stem tissue.
Transcript accumulation of Tdpmei genes has been investigated also following infection with the
fungal pathogen Bipolaris sorokiniana, but no increase in the level of transcripts was observed.
To verify the capability to modulate in planta the wheat endogenous PME activity, wheat
transgenic wheat plants overexpressing the Tdpmei7.3 were produced. T0 plants showed
different level of PME activity reduction that varied from about 10% to 85% of the control PME
activity.

Una delle strategie più promettenti nei programmi di miglioramento genetico riguarda sicuramente la
costituzione di varietà vegetali in grado di resistere all’aggressione dei patogeni, che rappresentano una delle
più serie minacce per la produttività agricola. Ciò può essere ottenuto rafforzando i meccanismi di difesa preesistenti
della pianta, come la struttura e la composizione della parete cellulare vegetale che è una delle
prime barriere che i patogeni devono superare per colonizzare il tessuto ospite. Per superare questo ostacolo,
la maggior parte dei patogeni fungini produce una serie di enzimi che degradano i polisaccaridi della parete
cellulare. Tra questi, gli enzimi pectici sono tra i primi ad essere secreti dai patogeni per poter penetrare e
colonizzare il tessuto ospite.
La pectina è secreta nella parete cellulare in forma altamente metilesterificata ed in seguito viene deesterificata
in muro dalle pectin metilesterasi (PME). L’attività delle PME contribuisce a modificare la
struttura della pectina, influenzandone anche la suscettibilità all’azione idrolitica degli enzimi pectici prodotti
dai patogeni. L’attività di questo enzima è modulata dall’interazione specifica con l’inibitore della pectin
metilesterasi (PMEI). Poiché le modificazioni della pectina sono associate a importanti processi fisiologici
della pianta e anche alle risposte di difesa ai patogeni, l’interazione PME-PMEI può rivestire un ruolo
biologico importante.
Dal momento che in frumento geni codificanti per l’inibitore della pectin metilesterasi non sono stati
caratterizzati, nel corso di questo lavoro sono stati isolati da frumento duro cv. Svevo tre geni, Tdpmei2.1,
Tdpmei2.2, Tdpmei7.3. E’ stato dimostrato che questi geni codificano per inibitori funzionali in grado di
ridurre l’attività della PME di arancio (Orange peel, OpPME). E’ stato anche dimostrato che gli inibitori
TdPMEI2.1, TdPMEI2.2 e TdPMEI7.3 sono in grado di inibire l’attività PME endogena di frumento,
mostrando una diversa specificità nei confronti dell’attività PME ottenuta da diversi tessuti. I tre inibitori non
mostrano attività inibitoria nei confronti di PME microbiche, come già descritto per altri PMEI.
I geni Tdpmei2.1 e Tdpmei2.2 sono localizzati sul braccio lungo dei cromosomi del gruppo 2 e presentano
una sequenza altamente conservata nei progenitori selvatici del frumento.
Per fare luce sul possibile ruolo fisiologico di questi inibitori, sono state eseguite analisi di espressione dei
tre geni in diversi tessuti ottenuti da piante a stadi di sviluppo differenti. I risultati hanno dimostrato che
l’espressione dei geni Tdpmei2.1 e Tdpmei2.2 è regolata da un meccanismo di splicing alternativo noto come
ritenzione dell’introne. E’ stato osservato che la completa rimozione dell’introne dei due geni avviene solo
nelle antere. I trascritti del Tdpmei7.3 sono presenti in tutti i tessuti analizzati ma mostrano un forte
accumulo a livello del culmo.
L’espressione dei tre geni pmei di frumento è stata analizzata anche in piante infettate con il patogeno
fungino Bipolaris sorokiniana. I risultati non hanno mostrato un incremento dell’accumulo dei trascritti in
seguito all’infezione.
Infine, la capacità in planta di modulare l’attività PME endogena è stata verificata tramite la produzione di
piante transgeniche di frumento sovra esprimenti il gene Tdpmei7.3. Analisi preliminari hanno mostrato che
le piante transgeniche mostrano vari livelli di riduzione dell’attività PME rispetto al wild type.

Un des requis pour le développement d’une agriculture durable est l’utilisation de variétés résistantes aux
microorganismes pathogènes. Dans cette optique, il semblerait particulièrement efficace de produire des
génotypes renforcés en des systèmes naturels de défense, comme la paroi cellulaire, qui constitue une
barrière pour nombreux pathogènes. La majeure partie des pathogènes produisent un arsenal enzymatique
capable d’hydrolyser les composants polysaccharidiques de la paroi. Parmi celle-ci les enzymes pectiques
revêtent un rôle primaire durant le procès d’infection.
La pectine est secrétée dans la paroi cellulaire sous forme hautement méthylesterifiée et après, par l’action du
pectin méthylestérase (PME), vient de-méthylesteréfiée. L’action de cet enzyme est contrôlée par
l’interaction spécifique avec l’inhibiteur de pectin méthylestérase (PMEI). Puisque la modification de pectine
est associée avec d’importantes phénomènes physiologiques et aussi avec les réponses de défense contre les
pathogènes, l’interaction PME-PMEI peut revêtir un rôle biologique très important.
Puisque les gènes pmei du blé n’ont été pas caractérisés, dans ces travaux de thèses trois gènes du blé dur ont
été isolés, Tdpmei2.1, Tdpmei2.2, Tdpmei7.3. On a démontré que les gènes codifient des inhibiteurs
fonctionnels qui sont capable de réduire l’activité du PME de l’ orange. Les trois inhibiteurs TdPMEI2.1,
TdPMEI2.2 et TdPMEI7.3 inhibent aussi l’activité PME endogène du blé avec un différent degré de
spécificité. Les trois inhibiteurs ne sont pas capable d’ inhiber l’activité PME du microorganismes.
Les gènes Tdpmei2.1 et Tdpmei2.2 sont localisée sur le bras long du chromosome du groupe 2 et leurs
séquences montrent un haut degré de conservation entre les espèces sauvages du blé.
Les analyses d’expressions ont été effectués durant les diverses phases du développement du blé. Les
résultats ont montré que l’expression des gènes Tdpmei2.1 et Tdpmei2.2 est réglée par le mécanisme de
rétention de l’intron. On a observé que les introns de ces gènes ont été complètement enlevés dans les
anthères. L’accumulation de transcrits du Tdpmei7.3 est majoritaire dans la tige.
Les analyses d’expressions ont été effectuées aussi après l’infection avec le champignon Bipolaris
sorokiniana et les résultats n’ont pas montré, pour les trois gènes d’intérêt, un dégrée d’accumulation
majoritaire dans les plantes infectés par rapport aux plantes non infectées. En fin, la capacité de moduler
l’activité PME in planta a été vérifiée avec la production de plantes transgéniques surexprimant le gène
Tdpmei7.3. Des analyses préliminaires ont montré que les plantes transgéniques ont un degré variable de
réduction de l’activité endogène PME par rapport aux plants non transformés.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2491
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