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Title: Eterogeneità ambientale e variabilità genetica in Aphanius fasciatus (Teleostea)
Other Titles: Environmental heterogeneity and genetic variability in Aphanius fasciatus (Teleostea)
Authors: Pontremolesi, Alessandra
Keywords: Aphanius fasciatus;Variabilità genetica;Allozimi;Microsatelliti;Acque salmastre;Selezione;Deriva genetica;Conservazione;Genetic variability;Allozymes;Microsatellites;Brackish waters;Selection;Genetic drift;Conservation;BIO/07
Issue Date: 10-Feb-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
Lo studio della diversità genetica riveste un ruolo fondamentale per la comprensione
di molti problemi di ecologia evolutiva. In particolare, la verifica del rapporto tra livelli di
variabilità genetica e caratteristiche ambientali è un argomento oggetto di molti studi ma non
ancora totalmente chiarito soprattutto per quanto riguarda l’importanza relativa dei diversi
meccanismi evolutivi coinvolti.
Questa tesi di dottorato aveva l’obiettivo di utilizzare il ciprinodonte di acque
salmastre Aphanius fasciatus per investigare l’influenza delle fluttuazioni ambientali sul pool
genico delle popolazioni naturali. Questa scelta è stata dettata da molteplici fattori, tra cui
l’esistenza di studi condotti precedentemente sulla popolazione di Aphanius fasciatus delle
Saline di Tarquinia, il che permette di estendere lo studio qui realizzato su un arco temporale
di più generazioni. Inoltre, la popolazione delle Saline di Tarquinia è stata soggetta ad un
progressivo inasprimento delle condizioni ambientali (a causa della dismissione
dell’impianto di produzione del sale e della conseguente mancanza di manutenzione) seguito
poi da un’azione di ripristino ecologico (Progetto LIFE Natura). Oltre alle periodiche
variazioni stagionali che caratterizzano gli ambienti lagunari in genere, in questo caso
specifico è stato quindi possibile monitorare la risposta evolutiva alla variazione della qualità
ambientale nel medio periodo. I campioni sono stati dunque studiati in relazione ai livelli di
stress ambientale riscontrati nei vari anni contemporaneamente alla realizzazione ed allo
svolgimento del progetto di ripristino ecologico: situazione tipica degli ambienti salmastri
(1998- pre LIFE); durante il picco di stress ambientale per mancanza di gestione (2003 –
2005 svolgimento LIFE); dopo aver diminuito i livelli di stress ambientale a seguito del
restauro ecologico delle saline (2007 – 2010 post LIFE).
Agli studi condotti mediante analisi degli allozimi è stata affiancata l’analisi dei
microsatelliti, marcatori attesi come ipervariabili e selettivamente neutrali, per valutare
l’incidenza delle diverse forze evolutive (principalmente deriva genetica e selezione, vista la
scarsa rilevanza del flusso genico in questa specie) nel plasmare la struttura genetica delle
popolazioni in presenza di condizioni ambientali stressanti.
Entrambi i marcatori utilizzati per questo studio (allozimi e microsatelliti)
concordano nel rilevare un fenomeno di erosione genetica (perdita di variabilità genetica)
associato al peggioramento della qualità ambientale ed all’estremizzazione delle condizioni
ecologiche che esso comporta: alte temperature e salinità estive con scarso ossigeno
disciolto. Questa erosione genetica è rilevabile ad un gran numero di loci (soprattutto
allozimici) ed è collegata ad un calo della dimensione effettiva della popolazione per cui è
verosimilmente dovuta all’azione di fenomeni di deriva genetica che portano alla perdita
casuale di alleli. Inoltre la scarsa circolazione all’interno delle vasche prima del recupero
ambientale ha favorito la creazione di un cline caratterizzato da un aumento di salinità e
temperature da nord a sud e da un corrispondente calo dell’ossigeno disciolto. A tale cline
ecologico corrisponde un cline genetico in cui l’allele ADA100 risulta negativamente
associato alla concentrazione di ossigeno. Questa osservazione fa supporre che l’azione della
selezione affianchi quella della deriva genetica ed è corroborata dal forte deficit di
eterozigoti e dai test statistici che indicano il locus ADA come un “outlier” sotto selezione a
differenza di tutti gli altri loci, allozimici e microsatelliti, che hanno andamenti comparabili e
selettivamente neutrali.
Contemporaneamente la minore, ed inattesa, variabilità genetica registrata per i loci
microsatelliti rispetto agli allozimi porta ad ipotizzare che in habitat eterogenei come le
saline, il mantenimento della variabilità ad alcuni loci codificanti sarebbe favorito attraverso
la selezione naturale e l’adattamento genetico ai vari microhabitat. In pratica, il pattern degli
allozimi sarebbe determinato dall’azione combinata di deriva e selezione, che
aumenterebbero di intensità nei medesimi periodi caratterizzati da forte pressione
ambientale, agendo però in direzioni opposte. La deriva eroderebbe la diversità genetica
mentre la selezione manterrebbe genotipi differenziati (e quindi polimorfismi) ad alcuni loci;
la prima forza agirebbe quindi su tutti i loci, mentre la seconda solo su alcuni di essi. Sui loci
microsatelliti, neutrali, sarebbe solamente la deriva genetica ad aumentare la propria intensità
e forza in condizioni ambientali estreme, attraverso la riduzione della dimensione effettiva
della popolazione (Ne), portando esclusivamente ad un calo dei livelli di polimorfismo.
E’ stato anche effettuato un confronto tra i livelli di variabilità genetica di diverse
popolazioni di A. fasciatus rappresentative dell’intero areale della specie. E’ stato così
evidenziato che l’estensione dell’habitat lagunare, le sue caratteristiche idrografiche e la sua
vicinanza ad altre lagune popolate da A. fasciatus, influiscono profondamente sulla struttura
genetica di questa specie. In ambienti dove non vi è eterogeneità ambientale e vi sono state
crisi distrofiche recenti che hanno interessato tutta la laguna con estese morie delle specie
ittiche, come ad esempio nella laguna di Orbetello, entrambi i marcatori portano il segno di
una drastica riduzione di Ne e mostrano una variabilità limitata. Invece, in contesti ambientali
fortemente eterogenei come le saline di Tarquinia, la riduzione ciclica della dimensione
effettiva di popolazione tende ad erodere la variabilità genetica, ma allo stesso tempo i
fenomeni selettivi innescati dalla marcata eterogeneità ambientale permettono il
mantenimento di una certa porzione di variabilità genetica collegata, direttamente o
indirettamente, alla risposta allo stress ambientale. Infine, in situazioni ambientali più
composite, come ad esempio lo Stagnone di Marsala, dove l’impianto di produzione del sale
ancora in funzione garantisce un ambiente meno estremo e dove inoltre, adiacente alla salina,
è presente una estesa laguna con ampi collegamenti al mare, capace di ospitare in condizioni
di omeostasi una popolazione di A. fasciatus vasta e demograficamente stabile, i livelli di
variabilità genetica vengono mantenuti alti. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che i due
ambienti, laguna e salina, agiscono mutuamente nel mantenere la variabilità: la laguna
garantisce una dimensione di popolazione ampia e stabile, mentre l’habitat eterogeneo delle
saline adiacenti può favorire l’affermazione di alcuni genotipi attraverso habitat choice e
selezione naturale.
L’esempio costituto dallo Stagnone di Marsala fornisce lo spunto per una
considerazione di carattere gestionale relativa agli ambienti lagunari in generale, ed alle
Saline di Tarquinia in particolare. La gestione di questi habitat per il mantenimento della
diversità genetica delle popolazioni residenti può beneficiare di un “modello” simile a quello
dello Stagnone di Marsala, con una zona che funga da stabile “polmone” adiacente ad una
zona gestita e con spiccata eterogeneità ambientale.

The study of genetic diversity is fundamental in understanding basic process in
evolutionary ecology. The relationships between the level of genetic diversity and the
ecological features of the habitat has been widely explored in recent years, but some doubt
still exists about the reciprocal relevance of the evolutionary mechanisms involved.
In this thesis the ciprinodont fish Aphanius fasciatus, typical of brackish waters, has
been studied to elucidate the influence of environmental fluctuations of the gene pool of
natural populations. The reason to make this choice has been, among others, that there are
previous studies carried on the population living at the Saline di Tarquinia (Tarquinia
Salterns) so that a mean term study, encompassing many generations, could be performed.
Also, the population inhabiting Tarquinia Salterns has undergone a progressive stiffening of
the environmental conditions due to the end of the salt production then followed by the
ecological restoration of the site (EU Life Natura Project). This implies that the site of study
allowed investigating the evolutionary response of local population not only to the seasonal
strong fluctuation of the environment but also to the progressive habitat degradation (and
subsequent recovery). The study has been therefore structured according to a time table
reflecting the levels of environmental stress recorded: basic situation, immediately after the
end of salt extraction (1998 – pre-LIFE); stressed situation, immediately before and during
the works for the ecological restoration (2003-2005 – LIFE stage); after the recovery of the
salterns (2007-2010 – after LIFE).
The genetic structure of A. fasciatus was investigated using allozymes (Mendelian
markers possibly under selection) and microsatellites (hypervariable and neutral Mendelian
markers) in order to evaluate the relevance of the main evolutionary forces in moulding the
gene pool of the species under stressing conditions. In particular, genetic drift and selection
were under score since gene flow is notably restricted in this species, due to the natural
fragmentation and isolation of its habitat, the coastal lagoons.
Both markers (allozymes and microsatellites) agree in evidencing that the stiffening
of the environmental conditions (increasing of water temperature and salinity and reduction
of dissolved oxygen) is associated with genetic erosion. This loss of genetic variability is
widespread over a relevant number of loci (mainly allozymic) and is associated to a decrease
of the effective size of the population (Ne), thus suggesting that the genetic drift is the
mechanism underlying the random loss of alleles recorded. Also, the reduced water
circulation among the salt-pans before the environmental recovery has determined a Nord-
South cline in the salinity (increasing) and oxygen concentration (decreasing). Coincident to
this cline there is a correspondent continuum variation at locus ADA, with the allele ADA100
negatively correlated to the oxygen concentration. This finding suggests that selective
processes are also in action and such hypothesis is supported by the finding of a significant
heterozygote deficit at ADA and by statistics showing ADA as an “outlier” locus candidate
for selection.
The comparison of allozyme and microsatellite data reveals some discrepancies,
mainly a low, unexpected variability at microsatellites in the Tarquinia sample. This
observation could be explained considering that in heterogeneous habitats, such as salterns,
the maintenance of genetic variability at coding loci may be due to natural selection,
favouring different genotypic arrays in different micro-habitats. In other words, the allozyme
pattern would be due to the combined action of both genetic drift and selection, acting
simultaneously during environmental stress, but in different directions: the genetic drift
would erode the genetic variability affecting all loci while selection would maintain different
genotypes (hence polymorphisms) at some coding loci. As a consequence, the stiffening of
the environmental conditions would increase the strength of genetic drift alone on
microsatellite (neutral) loci, causing a stronger decrease in the level of their polymorphism.
Another piece of data comes from the analysis of the genetic structure of some
populations of A. fasciatus representative of the whole species range. The results obtained
have shown that geographical and hydrographical features of the coastal habitat have a
notable influence on the genetic structure of A. fasciatus. In homogeneous habitats
characterized by high human impact and anoxic crises, such as Orbetello lagoon, both
allozymes and microsatellites show a significant decrease of the effective population size and
a low genetic variability. On the contrary, habitat characterized by an environmental
heterogeneity, as Tarquinia salterns are, show a balancing action of genetic drift and
selection so that a certain extent of genetic variability is maintained, linked to the adaptive
response to the environmental changes. Finally, there are “mix” environments, as in the
lagoon Stagnone di Marsala, where a large, stable lagoon is in close proximity to a still
operating saltern. Here high levels of genetic variability are observed with both markers.
This is likely due to the fact that the lagoon represents a steady habitat, hosting a
demographically stable population able to keep its own genetic variability, periodically
increased by the immigration of specimens from the nearby saltern, where the selective
processes and the habitat choice, associated to the fluctuating environmental conditions,
maintain a number of genotypic arrays.
The case of the Stagnone di Marsala provides some final considerations concerning
the conservation of coastal habitats, with particular regard to the Tarquinia salterns. If the
final aim of the management is the maintenance of high demographic numbers and genetic
variability of local populations, a good solution could be the to have a wider steady lagoon
neighbouring a smaller heterogeneous (in space and time) zone, this latter able to provide
different genotypes to the lagoon, warranting in turn a demographic stability.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche
URI: http://hdl.handle.net/2067/2475
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