Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2470
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorD'Ovidio, Renato-
dc.contributor.authorKalunke, Raviraj Mahadeo-
dc.date.accessioned2013-11-26T16:21:41Z-
dc.date.available2013-11-26T16:21:41Z-
dc.date.issued2012-04-11-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2067/2470-
dc.descriptionDottorato di ricerca in Biotecnologie vegetaliit
dc.description.abstractThe diseases caused by pathogenic fungi are major problem for grain production. It reduces the productivity and causes contamination of grain with mycotoxins, compounds that are harmful to human health and animals. Disease control can be done by chemical treatments but these are costly and adverse affect on the environment. The most efficient strategy to control crop diseases is the development of resistant genotypes. This goal can be achieved by enhancing specific plant defence mechanisms, among which the reinforcement of plant cell wall compartment can be one of the most efficient because most pathogens have to overcome this barrier to colonize the host tissue. Plant cell walls consist mainly of polysaccharides (i.e. cellulose, hemicelluloses and pectins) and play an important role in defending against pathogens. Many pathogenic fungi can produce a range of cell wall-degrading extracellular enzymes (CWDEs) that are capable of depolymerizing the polysaccharides in the host cell wall. CWDEs are the polysaccharide degrading enzymes, including exo- and endo-polygalacturonases, pectin methylesterases, pectin and pectate lyases, acetyl esterases, xylanases and a variety of endoglucanases that cleave cellulose, xyloglucan and other glucans. During the defence response plant produces protein inhibitors of CWDE. The polygalacturonase inhibitor protein (PGIP) inhibits endopolygalacturonase (PG) secreted by fungal pathogens. The degree and pattern of cell wall pectin methyl-esterification can also influence plant resistance, as highly methyl-esterified pectin is less susceptible to the hydrolysis by fungal PGs. Pectin methyl esterification is controlled by the interaction between pectin methyl esterase (PME) and its protein inhibitor (PMEI). The PGIP and PMEI play an important role in preventing action of PG on pectin. Cereals contain Xylanase inhibitors (XIs) which inhibit microbial Xylanases, from glycoside hydrolase families 10 and 11. Endo β-1,4-xylanases (xylanases; EC 3.2.1.8) are key enzymes in the degradation of arabinoxylans (AXs), the main non-starch polysaccharides from cereal cell walls. The main objective of this study was to pyramid glycosidase inhibitor genes (PGIP, PMEI and XI), evaluate their co-segregation frequency and their combined effect on wheat resistance against fungal pathogens in wheat. In order to achieve this goal, multi-transgenes-stacking of PGIP, PMEI and XI in wheat was carried out by two approaches, multiple plasmid co-transformation and classical crossing. In the co-transformation approach, four plasmids containing Pvpgip, Acpmei, Taxi-III and bar genes in wheat T. durum cv. Svevo were co-transformed by particle bombardment. Total sixteen T0 plants were obtained, among them seven plants showed all four genes which represents 58% cotransformation frequency for four transgenes. Further, seeds were harvested and used for T1 segregation analysis. All the four transgenes co-segregated at ratio of 3:1, indicating that all four genes are tightly linked in all seven lines. Similar co-transformation experiments were performed in bread wheat (T. avesticum cv. Bobwhite) using four plasmids each containing PvPGIP2, AcPMEI Xip-III and bar genes. Total eighteen T0 plants were obtained, among them five plants showed all four transgenes which represent 27.77 % co-transformation frequency for four transgenes. Further, seeds were harvested and used for T1 segregation analysis. All the four transgenes co-segregated at ratio of 3:1, indicating that all four genes tightly linked in all lines. Segregation analysis in both durum and bread wheat showed about 70% progeny contained all three transgenes of interest together and also tightly linked. In crossing approach, parental lines of durum wheat cv Svevo each expressing single glycosidase inhibitor were crossed. First, plant containing PvPGIP2/AcPMEI were obtained, and these plants were crossed with a line expressing TAXI-III. In F1 progeny, a total of nineteen F1 plants were obtained, with only two plants possessing all three transgenes. Among these two plants, one plant (M011-1-5) exhibited high level of expression for PGIP and TAXI-III along with inhibition activity but, for PMEI no inhibition activity was observed, probably caused by silencing events. The remaining one plant (M011-1-4) exhibited high level expression for all three genes and their corresponding inhibitory activity. The segregation analysis F2 progeny of this plant (M011-1-4) showed only 10% of the segregating progeny with all three transgenes of interest Our results indicate that multi-stacking-transgenes using co-transformation can perform better than the classical crossing approach since more than 70% of the progenies were with three transgenes of interest and also tightly linked. On the contrary, in the crossing method only 10% of the segregating progeny contained all three glycosidase inhibitors. Three transgenic durum wheat lines containing tightly linked PvPGIP2, AcPMEI and TAXI-III (lines MJ56-5, MJ56-16a and MJ56-16b) were analyzed for transgene expression and inhibition activity. All three transgenic lines exhibited high level of expression for PMEI and TAXI-III along with inhibition activity but, for PGIP a very low expression and no inhibition activity was observed, probably becaused of gene silencing events. T2 generations of these three lines were used to analyze their resistance response to B. sorokiniana infection. The results showed about 70 % reduction in Leaf bloch disease symptom. This level of protection is higher than that obtained with the overexpression of only AcPMEI (about 55%) in durum wheat (Volpi et al. 2011), probably because of the co-presence of TAXI-III. However, the possibility that a higher level of PMEI activity in these transgenic plants, compared to those analysed by Volpi et al. (2011) is responsible for the higher protection cannot be ruled out.en
dc.description.abstractLa malattie causate da patogeni fungini sono uno dei principali problemi per la produzione cerealicola, queste malattie riducono la produttività e causano la contaminazione del grano con micotossine, composti pericolosi per la salute umana e animale. Il controllo delle malattie può essere effettuato utilizzando trattamenti chimici che però sono svantaggiosi dal punto di vista economico e ambientale. La strategia più efficace per controllare le malattie delle colture di interesse agrario è lo sviluppo di genotipi resistenti. Ciò può essere ottenuto potenziando specifici meccanismi di difesa della pianta, per esempio il rafforzamento della parete cellulare può essere una strategia efficace perchè la maggior parte dei patogeni deve superare questa barriera per colonizzare il tessuto ospite. La parete cellulare vegetale è costituita principalmente da polisaccaridi ( cellulosa, emicellulose e pectine) e svolge un importante ruolo nella difesa contro i patogeni. Molti patogeni fungini producono degli enzimi extracellulari che degradano la parete cellulare (CWDE) ;essi sono in grado di depolimerizzare i polisaccaridi presenti nella parete cellulare della pianta ospite. I CWDE sono gli enzimi che degradano la parete cellulare e includono eso e endopoligalatturonasi, pecti metilesterasi, pectina e pectato liasi, acetil esterasi, xilanasi e una varietà di endoglucanasi che degradano la cellulosa, lo xiloglucano e gli altri glucani. Nella risposta di difesa la pianta produce proteine inibitrici dei CWDE. La proteina inibitrice delle poligalatturonasi (PGIP) inibisce le endopoligalatturonasi (PG) secrete dai funghi patogeni. Il grado e il pattern di metil esterificazione della parete cellulare possono influenzare la resistenza della pianta, infatti la pectina altamente metil esterificata è meno suscettibile all’idrolisi da parte delle PG fungine. La pectin metil esterificazione è controllata attraverso l’interazione tra la pectin metil esterasi (PME) e i suoi inibitori proteici (PMEI). Le proteine PGIP e PMEI svolgono u ruolo importante nel prevenire l’azine delle PG sulle pectine. I cereali contengono inibitori di xilanasi (XI) che inibiscono le xilanasi microbiche appartenenti alle famiglie 10 e 11 delle glicoside idrolasi. Le Endo β-1,4- xilanasi (xilanasi; EC 3.2.1.8) sono enzimi chiave nella degradazione degli arabinoxilani (AXs), il maggior polisaccaride non amidaceo della parete cellulare del frumento. L’obiettivo principale di questo studio è stato quello di piramidare geni inibitori di glicosidasi (PGIP, PMEI e XI) e valutare il loro effetto combinato sulla resistenza del frumento ai patogeni fungini. Per raggiungere questo obiettivo è stato effettuato un trasferimento multiplo di transgeni (multi-transgenes-stacking) PGIP, PMEI e XI in frumento utilizzando due strategie: la cotrasformazine con plasmidi multipli e l’incrocio tradizionale. Nell’approccio di co-trasformazione sono stati utilizzati quattro plasmidi contenenti i geni Pvpgip, Acpmei, Taxi-III e bar per trasformare mediante il metodo biolistico il frumento duro cv Svevo. Sono state ottenute in tutto sedici piante T0 di cui sette piante hanno mostrato la presenza di tutti e quatto i transgeni con una frequenza di co-trasformazione del 58%. Quindi sono stati raccolti i semi T1 e sono stati utilizzati per effettuare l’analisi della segregazione Tutti e quattro i transgeni cosegregano con un rapporto di 3:1, indicando che tutti e quattro i geni sono strettamente associati in tutte e sette le linee. Esperimenti simili di co-trasformazione sono stati effettuati in frumento tenero (T. avesticum cv. Bobwhite) utilizzando quattro plasmidi contenenti i geni PvPGIP2, AcPMEI Xip- III e bar. Sono state ottenute in totale diciotto piante T0, di queste cinque piante hanno mostrato la presenza di tutti e quattro i transgeni, ciò rappresenta una frequenza di co-trasformazione per i quattro transgeni del 27.77 % . Quindi sono stati raccolti i semi T1 ed è stata condotta l’analisi della segregazione. Tutti e quattro i transgeni segregano con una rapporto di 3:1, indicando che tutti e quattro sono strettamente associati in tutte le linee. L’analisi della segregazione in entrambi il grano duro e tenero ha mostrato che circa il 70% della progenie conteneva tutti e tre i transgeni di interesse e che essi erano inoltre strettamente associati. Nell’approccio che ha previsto l’ incrocio tradizionale, sono state incrociate le linee parentali di frumento duro cv Svevo, ognuna esprimente un singolo inibitore di glicoside idrolasi. Per prima cosa sono state ottenute piante contenenti PvPGIP2 e AcPMEI,quindi queste piante sono state incrociate con una linea esprimente TAXI-III. Nella progenie F1 sono state ottenute in totale diciannove piante di cui due contenenti tutti e tre i transgeni. Di queste due piante, una (M011-1-5) ha mostrato un alto livello di espressione di PGIP e TAXI III con presenza di attività inibitoria ma non è stata rilevata alcuna attività inibitoria da parte di PMEI, probabilmente a causa di un evento di silenziamento. L’altra pianta (M011-1-4) ha mostrato un alto livello di espressione di tutti e tre i transgeni e la presenza della corrispondente attività inibitoria. L’analisi di segregazione della progenie F2 della pianta M011-1-4 ha mostrato che il 10% della progenie segregante conteneva tutti e tre i transgeni di interesse. Ciò conferma che nel nostro caso l’approccio della co-trasformazione si è rivelato migliore per l’inserimento di transgeni multipli ,con il 70% della progenie contenente i tre transgeni di interesse e anche strettamente associati.; al contrario nel metodo che ha previsto l’incrocio solo il 10% della progenie segregante mostrava i tre transgeni. Le linee di frumento duro contenenti i transgeni PvPGIP2, AcPMEI e TAXI-III strettamente associati (linee MJ56-5, MJ56-16a e MJ56-16b) sono state analizzate per l’espressione dei transgeni e per l’attività inibitoria. Tutte e tre le linee hanno mostrato un alto livello di espressione di PMEI e TAXI-III con attività inibitoria, ma per PGIP è stata osservata una espressione molto bassa senza attività inibitoria, probabilmente causata da eventi di silenziamento del transgene. Le generazioni T2 di queste tre linee sono state usate per analizzare la risposta di resistenza all’infezione di B. sorokiniana e hanno mostrato una riduzione dei sintomi della malattia in foglia del 70%. Questo livello di protezione è più alto di quello rilevato in piante di frumento duro sovraesprimenti AcPMEI( 55% circa), riportato da Volpi et al. (2011); ciò è probabilmente dovuto alla co-presenza di TAXI-III, comunque non può essere esclusa la possibilità che un più alto livello di attività PMEI in queste piante transgeniche sia responsabile di una maggiore protezione.it
dc.language.isoenit
dc.publisherUniversità degli studi della Tuscia - Viterboit
dc.relation.ispartofseriesTesi di dottorato di ricerca. 24. cicloit
dc.subjectMultitransgene stackingen
dc.subjectGlycosidase inhibitorsen
dc.subjectDisease resistanceen
dc.subjectTransgenic wheaten
dc.subjectInibitori della glicosidasiit
dc.subjectResistenza alle malattieit
dc.subjectGrano transgenicoit
dc.subjectAGR/07it
dc.subjectPiramidazione di transgenien
dc.titleMulti-transgene-stacking of glycosidase inhibitor genes to improve resistance against fungal pathogens in wheat-
dc.title.alternativePiramidazione degli inibitori della glicosidasi per migliorare la resistenza del frumento ai patogeni funginiit
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.rights.accessRightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessen
item.fulltextWith Fulltext-
item.openairetypeDoctoral Thesis-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1en-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
Appears in Collections:Archivio delle tesi di dottorato di ricerca
Files in This Item:
File Description SizeFormat
rmkalunke_tesid.pdf3.08 MBAdobe PDFView/Open
Show simple item record

Page view(s)

156
Last Week
0
Last month
3
checked on Mar 27, 2024

Download(s)

129
checked on Mar 27, 2024

Google ScholarTM

Check


All documents in the "Unitus Open Access" community are published as open access.
All documents in the community "Prodotti della Ricerca" are restricted access unless otherwise indicated for specific documents