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Title: Multi-transgene-stacking of glycosidase inhibitor genes to improve resistance against fungal pathogens in wheat
Other Titles: Piramidazione degli inibitori della glicosidasi per migliorare la resistenza del frumento ai patogeni fungini
Authors: Kalunke, Raviraj Mahadeo
Keywords: Multitransgene stacking;Glycosidase inhibitors;Disease resistance;Transgenic wheat;Inibitori della glicosidasi;Resistenza alle malattie;Grano transgenico;AGR/07;Piramidazione di transgeni
Issue Date: 11-Apr-2012
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 24. ciclo
Abstract: 
The diseases caused by pathogenic fungi are major problem for grain production. It reduces the
productivity and causes contamination of grain with mycotoxins, compounds that are harmful to
human health and animals. Disease control can be done by chemical treatments but these are costly
and adverse affect on the environment. The most efficient strategy to control crop diseases is the
development of resistant genotypes. This goal can be achieved by enhancing specific plant defence
mechanisms, among which the reinforcement of plant cell wall compartment can be one of the most
efficient because most pathogens have to overcome this barrier to colonize the host tissue. Plant cell
walls consist mainly of polysaccharides (i.e. cellulose, hemicelluloses and pectins) and play an
important role in defending against pathogens. Many pathogenic fungi can produce a range of cell
wall-degrading extracellular enzymes (CWDEs) that are capable of depolymerizing the
polysaccharides in the host cell wall. CWDEs are the polysaccharide degrading enzymes, including
exo- and endo-polygalacturonases, pectin methylesterases, pectin and pectate lyases, acetyl
esterases, xylanases and a variety of endoglucanases that cleave cellulose, xyloglucan and other
glucans. During the defence response plant produces protein inhibitors of CWDE. The
polygalacturonase inhibitor protein (PGIP) inhibits endopolygalacturonase (PG) secreted by fungal
pathogens. The degree and pattern of cell wall pectin methyl-esterification can also influence plant
resistance, as highly methyl-esterified pectin is less susceptible to the hydrolysis by fungal PGs.
Pectin methyl esterification is controlled by the interaction between pectin methyl esterase (PME)
and its protein inhibitor (PMEI). The PGIP and PMEI play an important role in preventing action of
PG on pectin. Cereals contain Xylanase inhibitors (XIs) which inhibit microbial Xylanases, from
glycoside hydrolase families 10 and 11. Endo β-1,4-xylanases (xylanases; EC 3.2.1.8) are key
enzymes in the degradation of arabinoxylans (AXs), the main non-starch polysaccharides from
cereal cell walls.
The main objective of this study was to pyramid glycosidase inhibitor genes (PGIP, PMEI and XI),
evaluate their co-segregation frequency and their combined effect on wheat resistance against
fungal pathogens in wheat. In order to achieve this goal, multi-transgenes-stacking of PGIP, PMEI
and XI in wheat was carried out by two approaches, multiple plasmid co-transformation and
classical crossing.
In the co-transformation approach, four plasmids containing Pvpgip, Acpmei, Taxi-III and bar genes
in wheat T. durum cv. Svevo were co-transformed by particle bombardment. Total sixteen T0 plants
were obtained, among them seven plants showed all four genes which represents 58% cotransformation
frequency for four transgenes. Further, seeds were harvested and used for T1
segregation analysis. All the four transgenes co-segregated at ratio of 3:1, indicating that all four
genes are tightly linked in all seven lines. Similar co-transformation experiments were performed in
bread wheat (T. avesticum cv. Bobwhite) using four plasmids each containing PvPGIP2, AcPMEI
Xip-III and bar genes. Total eighteen T0 plants were obtained, among them five plants showed all
four transgenes which represent 27.77 % co-transformation frequency for four transgenes. Further,
seeds were harvested and used for T1 segregation analysis. All the four transgenes co-segregated at
ratio of 3:1, indicating that all four genes tightly linked in all lines.
Segregation analysis in both durum and bread wheat showed about 70% progeny contained all
three transgenes of interest together and also tightly linked.
In crossing approach, parental lines of durum wheat cv Svevo each expressing single glycosidase
inhibitor were crossed. First, plant containing PvPGIP2/AcPMEI were obtained, and these plants
were crossed with a line expressing TAXI-III. In F1 progeny, a total of nineteen F1 plants were
obtained, with only two plants possessing all three transgenes. Among these two plants, one plant
(M011-1-5) exhibited high level of expression for PGIP and TAXI-III along with inhibition activity
but, for PMEI no inhibition activity was observed, probably caused by silencing events. The
remaining one plant (M011-1-4) exhibited high level expression for all three genes and their
corresponding inhibitory activity. The segregation analysis F2 progeny of this plant (M011-1-4)
showed only 10% of the segregating progeny with all three transgenes of interest
Our results indicate that multi-stacking-transgenes using co-transformation can perform better than
the classical crossing approach since more than 70% of the progenies were with three transgenes of
interest and also tightly linked. On the contrary, in the crossing method only 10% of the segregating
progeny contained all three glycosidase inhibitors.
Three transgenic durum wheat lines containing tightly linked PvPGIP2, AcPMEI and TAXI-III
(lines MJ56-5, MJ56-16a and MJ56-16b) were analyzed for transgene expression and inhibition
activity. All three transgenic lines exhibited high level of expression for PMEI and TAXI-III along
with inhibition activity but, for PGIP a very low expression and no inhibition activity was observed,
probably becaused of gene silencing events. T2 generations of these three lines were used to analyze
their resistance response to B. sorokiniana infection. The results showed about 70 % reduction in
Leaf bloch disease symptom. This level of protection is higher than that obtained with the
overexpression of only AcPMEI (about 55%) in durum wheat (Volpi et al. 2011), probably because
of the co-presence of TAXI-III. However, the possibility that a higher level of PMEI activity in
these transgenic plants, compared to those analysed by Volpi et al. (2011) is responsible for the
higher protection cannot be ruled out.

La malattie causate da patogeni fungini sono uno dei principali problemi per la produzione
cerealicola, queste malattie riducono la produttività e causano la contaminazione del grano con
micotossine, composti pericolosi per la salute umana e animale. Il controllo delle malattie può
essere effettuato utilizzando trattamenti chimici che però sono svantaggiosi dal punto di vista
economico e ambientale. La strategia più efficace per controllare le malattie delle colture di
interesse agrario è lo sviluppo di genotipi resistenti. Ciò può essere ottenuto potenziando specifici
meccanismi di difesa della pianta, per esempio il rafforzamento della parete cellulare può essere
una strategia efficace perchè la maggior parte dei patogeni deve superare questa barriera per
colonizzare il tessuto ospite. La parete cellulare vegetale è costituita principalmente da polisaccaridi
( cellulosa, emicellulose e pectine) e svolge un importante ruolo nella difesa contro i patogeni.
Molti patogeni fungini producono degli enzimi extracellulari che degradano la parete cellulare
(CWDE) ;essi sono in grado di depolimerizzare i polisaccaridi presenti nella parete cellulare della
pianta ospite. I CWDE sono gli enzimi che degradano la parete cellulare e includono eso e endopoligalatturonasi,
pecti metilesterasi, pectina e pectato liasi, acetil esterasi, xilanasi e una varietà di
endoglucanasi che degradano la cellulosa, lo xiloglucano e gli altri glucani. Nella risposta di difesa
la pianta produce proteine inibitrici dei CWDE. La proteina inibitrice delle poligalatturonasi (PGIP)
inibisce le endopoligalatturonasi (PG) secrete dai funghi patogeni. Il grado e il pattern di metil
esterificazione della parete cellulare possono influenzare la resistenza della pianta, infatti la pectina
altamente metil esterificata è meno suscettibile all’idrolisi da parte delle PG fungine. La pectin
metil esterificazione è controllata attraverso l’interazione tra la pectin metil esterasi (PME) e i suoi
inibitori proteici (PMEI). Le proteine PGIP e PMEI svolgono u ruolo importante nel prevenire
l’azine delle PG sulle pectine. I cereali contengono inibitori di xilanasi (XI) che inibiscono le
xilanasi microbiche appartenenti alle famiglie 10 e 11 delle glicoside idrolasi. Le Endo β-1,4-
xilanasi (xilanasi; EC 3.2.1.8) sono enzimi chiave nella degradazione degli arabinoxilani (AXs), il
maggior polisaccaride non amidaceo della parete cellulare del frumento.
L’obiettivo principale di questo studio è stato quello di piramidare geni inibitori di glicosidasi
(PGIP, PMEI e XI) e valutare il loro effetto combinato sulla resistenza del frumento ai patogeni
fungini. Per raggiungere questo obiettivo è stato effettuato un trasferimento multiplo di transgeni
(multi-transgenes-stacking) PGIP, PMEI e XI in frumento utilizzando due strategie: la cotrasformazine
con plasmidi multipli e l’incrocio tradizionale.
Nell’approccio di co-trasformazione sono stati utilizzati quattro plasmidi contenenti i geni Pvpgip,
Acpmei, Taxi-III e bar per trasformare mediante il metodo biolistico il frumento duro cv Svevo.
Sono state ottenute in tutto sedici piante T0 di cui sette piante hanno mostrato la presenza di tutti e
quatto i transgeni con una frequenza di co-trasformazione del 58%. Quindi sono stati raccolti i semi
T1 e sono stati utilizzati per effettuare l’analisi della segregazione Tutti e quattro i transgeni cosegregano
con un rapporto di 3:1, indicando che tutti e quattro i geni sono strettamente associati in
tutte e sette le linee. Esperimenti simili di co-trasformazione sono stati effettuati in frumento tenero
(T. avesticum cv. Bobwhite) utilizzando quattro plasmidi contenenti i geni PvPGIP2, AcPMEI Xip-
III e bar. Sono state ottenute in totale diciotto piante T0, di queste cinque piante hanno mostrato la
presenza di tutti e quattro i transgeni, ciò rappresenta una frequenza di co-trasformazione per i
quattro transgeni del 27.77 % .
Quindi sono stati raccolti i semi T1 ed è stata condotta l’analisi della segregazione. Tutti e quattro i
transgeni segregano con una rapporto di 3:1, indicando che tutti e quattro sono strettamente
associati in tutte le linee. L’analisi della segregazione in entrambi il grano duro e tenero ha mostrato
che circa il 70% della progenie conteneva tutti e tre i transgeni di interesse e che essi erano inoltre
strettamente associati.
Nell’approccio che ha previsto l’ incrocio tradizionale, sono state incrociate le linee parentali di
frumento duro cv Svevo, ognuna esprimente un singolo inibitore di glicoside idrolasi. Per prima
cosa sono state ottenute piante contenenti PvPGIP2 e AcPMEI,quindi queste piante sono state
incrociate con una linea esprimente TAXI-III. Nella progenie F1 sono state ottenute in totale
diciannove piante di cui due contenenti tutti e tre i transgeni. Di queste due piante, una (M011-1-5)
ha mostrato un alto livello di espressione di PGIP e TAXI III con presenza di attività inibitoria ma
non è stata rilevata alcuna attività inibitoria da parte di PMEI, probabilmente a causa di un evento di
silenziamento. L’altra pianta (M011-1-4) ha mostrato un alto livello di espressione di tutti e tre i
transgeni e la presenza della corrispondente attività inibitoria. L’analisi di segregazione della
progenie F2 della pianta M011-1-4 ha mostrato che il 10% della progenie segregante conteneva tutti
e tre i transgeni di interesse.
Ciò conferma che nel nostro caso l’approccio della co-trasformazione si è rivelato migliore per
l’inserimento di transgeni multipli ,con il 70% della progenie contenente i tre transgeni di interesse
e anche strettamente associati.; al contrario nel metodo che ha previsto l’incrocio solo il 10% della
progenie segregante mostrava i tre transgeni.
Le linee di frumento duro contenenti i transgeni PvPGIP2, AcPMEI e TAXI-III strettamente
associati (linee MJ56-5, MJ56-16a e MJ56-16b) sono state analizzate per l’espressione dei transgeni
e per l’attività inibitoria. Tutte e tre le linee hanno mostrato un alto livello di espressione di PMEI e
TAXI-III con attività inibitoria, ma per PGIP è stata osservata una espressione molto bassa senza
attività inibitoria, probabilmente causata da eventi di silenziamento del transgene. Le generazioni T2
di queste tre linee sono state usate per analizzare la risposta di resistenza all’infezione di B.
sorokiniana e hanno mostrato una riduzione dei sintomi della malattia in foglia del 70%. Questo
livello di protezione è più alto di quello rilevato in piante di frumento duro sovraesprimenti
AcPMEI( 55% circa), riportato da Volpi et al. (2011); ciò è probabilmente dovuto alla co-presenza
di TAXI-III, comunque non può essere esclusa la possibilità che un più alto livello di attività PMEI
in queste piante transgeniche sia responsabile di una maggiore protezione.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2470
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