Innovative approach to pharmaceutical biotechnology based on Layer-by-Layer technique

Abstract

In recent years, the use of enzymes as natural catalysts has received a great attention in the development of organic synthesis, especially in the frame of green chemistry. In fact, due to the high chemical and energy efficiency of enzymatic transformations, biocatalysis is one of the greenest technologies that works perfectly with the emerging trend of bio-based sustainable feedstock. Indeed, biocatalysts can prevent waste generation by performing catalytic processes with high chemo-, stereo- and regio- selectivity under very mild reaction conditions of temperature, pH, pressure and solvent, working predominantly in aqueous systems. These properties minimize the problems of undesired side reactions and make the processes environmentally friendly. In addition to the unquestionable advantages, there are some drawbacks that lead to a limitation of enzymes for industrial applications: the high cost of isolation and purification of enzymes; the instability of their structures once they are isolated from their natural environments; their sensitivity both to process conditions other than the optimal ones, normally narrow-ranged, and to trace levels of substances that can act as inhibitors. Also, unlike conventional heterogeneous chemical catalysts, most enzymes operate dissolved in water in homogeneous catalysis systems, which is why they contaminate the product and cannot be recovered in the active form from reaction mixtures for reuse. Several methods have been proposed to overcome these limitations, one of the most successful being enzyme immobilization. Immobilization is achieved by fixing enzymes to or within solid supports. By mimicking the natural mode of occurrence in living cells, where enzymes for the most cases are attached to cellular membranes, the systems stabilize the structure of enzymes, hence their activities. Thus, as compared to free enzymes in solution, immobilized enzymes are more robust and more resistant to environmental changes. I\/lore importantly, the heterogeneity of the immobilized enzyme systems allows easy recovery of enzyme and product, multiple reuses of enzymes, continuous operation of enzymatic processes, rapid termination of reactions and greater variety of bioreactor designs. Nevertheless, compared with the free enzyme, the immobilized enzyme has usually its activity lowered and the Michaelis-Menten constant increased. These alterations result from structural changes introduced to the enzyme by the applied immobilization procedure and from the creation of a microenvironment in which the enzyme works, different from the bulk solution. In spite of these disadvantages, the creation of a microenvironment may allow to the enzyme to remain active at different temperatures or pHs than would be predicted when immobilization do not occurs, increasing the application possibilities. The present PhD project will be focused on the development and characterization of novel immobi ization systems of oxidative enzymes based on the Layer-by-Layer (LbL) method, and on their applicat'on to pharmaceutical biotechnologies. In part'cular, tyrosinase from Agaricus bisporus and laccase from Trametes versico/or were immobi ized through two different procedures: > Chemical immobilization, using the commercially available epoxy-resin Eupergit®C25OL as support; > Layer-by-Layer immobilization, based on the consecutive deposition of alternatively charged polyelectrolytes onto a surface to form microcapsules. The polyelectrolyte films have the ability to protect proteins from high-molecular-weight denaturing agents or bacteria and to allow regulation of the permeability towards small substrates, which can enter the multilayer and react with the catalytic site. Specifically, poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS) was chosen as negative layer and poly(allylamine hydrochloride) (PAH) as positive one. The polyelectrolytes deposition took place on two different surfaces: one consisted of chemically immobilized enzymes on Eupergit®C25OL and the other formed by enzymes supported on particles of aluminum oxide (AIZO3). Novel heterogeneous biocatalysts were first characterized for their kinetic properties and assayed for their stability to changes in pH and temperature, and then they were used as catalysts for the synthesis of high added-value molecules. In detail, tyrosinase-based biocatalysts were applied for the synthesis of catechols that are molecules with significant pharmaceutical properties, including antioxidant and antitumoral activities. The synthesis of catechols was conducted both in aqueous than in biphasic medium, using dichloromethane and buffer as solvent. Laccase-based biocatalysts were applied in the oxidation of alcohols to aldehyde in presence of molecular mediator. Both enzymes, tyrosinase and laccase, performed reactions using dioxygen as the primary oxidant. Data showed that the immobilization procedures increased the enzyme stability in the temperature and pHs conditions assayed, being the LbL systems the most steady biocatalysts. Furthermore, although heterogeneous enzymes were characterized by a slight decrease in catalytic efficiency (lower Vmax and higher Km), they showed reactivity comparable to free enzyme when applied in the oxidation of organic compounds, conducting reactions with high yields and conversions of substrate. Moreover, immobilization allows easy recovery of the catalyst from the reaction mixture and its recycling for more consecutive oxidation processes. For these numerous advantages, immobilization procedures are suitable for possible industrial applications, representing an efficient alternative to expensive and polluting chemical procedures for the preparation of these families of bioactive compounds.

Negli ultimi anni, l'uso degli enzimi come catalizzatori naturali ha ricevuto un interesse sempre maggiore per la sintesi di composti organici, specialmente nell'ambito della "green chemistry". Grazie all'alta efficienza chimlica ed ener8etica delle trasformazioni enzimatiche, la biocatalisi e una delle tecnologie piu ecocompatibili che lavora in accordo con le emergenti esigenze di usare materie prime sostenibili. La biocatal'si, infatti, previene la formazione di rifiuti conducendo le reazioni con un'alta chemo-, stereo- e reg'o- selettivita in condizioni blande di reazioni, in termini di temperatura, pH, pressione e solvente, lavorando prevalentemente in mezzo acquoso. Questi aspetti limitano i problemi correlati alla formazione di prodotti collaterali dannosi rendendo i processi ecocompatibili. In aggiunta ai numerosi vantaggi, esiste pero una serie di problemi pratici che limitano l'uso degli enzimi per applicazioni a livello industriale: gli alti costi di purificazione enzimatica; l'instabilita della struttura degli enzimi una volta che vengono isolati dal loro ambiente naturale; la loro sensibilita alle condizioni di reazione e alla presenza, anche in tracce, di sostanze che possono inibirne l'attivita. lnoltre, a differenza dei convenzionali catalizzatori chimici eterogenei, la maggior parte degli enzimi lavora in condizioni omogenee in soluzione acquosa, contaminando cosi i prodotti di reazione e rendendo impossibile un loro facile recupero e riciclo per piu processi catalitici consecutivi. Per superare i limiti associati alla biocatalisi, sono state sviluppate diverse strategie, tra cui la piu efficiente e l'immobilizzazione. L'immobilizzazione consiste nel fissare l'enzima sulla superficie o all'interno di supporti solidi inerti e insolubili. In questo modo, mimandone lo stato naturale nelle cellule viventi, dove, per la maggior parte dei casi sono ancorati alle membrane cellulari, i sistemi eterogenei stabilizzano la struttura degli enzimi e ne aumentano l'attivita. In questo modo, a differenza di quelli liberi, gli enzimi immobilizzati sono piu stabili e resistenti alle variazioni delle condizioni di reazione. L'eterogeneita del sistema permette, inoltre, un facile recupero dei prodotti, il riciclo dei catalizzatori per processi enzimatici a funzionamento continuo, un rapido arresto delle reazioni e una piu grande varieta di bioreattori. L'immobilizzazione e caratterizzata comunque da alcuni svantaggi. Rispetto alla sua forma nativa, infatti, l'enzima immobilizzato presenta un'attivita catalitica piu bassa e una piu alta costante di Michaelis-Menten. Queste alterazioni dei parametri cinetici derivano da cambiamenti nella struttura terziaria della proteina indotti dalla procedura d'immobilizzazione applicata e dalla creazione di un microambiente all'interno del quale l'enzima svolge la sua attivita che e differente rispetto alla miscela di reazione. La creazione di un microambiente tuttavia ha anche un effetto protettivo nei confronti della molecola proteica, permettendo all'enzima di rimanere attivo a temperature o valori di pH differenti rispetto all'enzima nella sua forma nativa, estendendo cosi le sue possibilita di applicazione. ll presente progetto di ricerca e incentrato sullo sviluppo e caratterizzazione di sistemi di immobilizzazione enzimatica, basati sulla tecnica Layer-by-Layer (LbL), applicati alle biotecnologie farmaceutiche. In particolare la tirosinasi estratta da Agaricus bisporus e la laccasi purificata da Trametes versicolor sono state immobilizzate attraverso due diverse procedure: > Immobilizzazione chimica, usando come supporto la resina commerciale Eupergit C25OL; > Immobilizzazione Layer-by-Layer, basata sulla deposizione di polielettroliti a carica opposta su di una superficie in modo da formare microcapsule. Lo strato polielettrolitico ha la funzione di proteggere le proteine da batteri o agenti denaturanti ad alto perso molecolare e permette di regolare l'accesso al sito attivo della proteina; solo substrati di piccole dimensioni possono facilmente diffondere attraverso gli strati e reagire con l'enzima. In dettaglio, il sodio polistirene solfonato (PSS) e stato scelto come polielettrolita a carica negativa, mentre la poliallilammina idrocloruro (PAH) come quello a carica positiva. La deposizione e avvenuta su due diverse superfici, una costituita dagli enzimi immobilizzati per via chimica su Eupergit C25OL e l'altra costituita dagli enzimi supportati su particelle di ossido di alluminio (AIZO3). I biocatalizzatori eterogenei cosi sintetizzati sono stati prima caratterizzati per via cinetica e studiati per valutare la loro stabilita alle variazioni di pH e di temperatura, e poi sono stati impiegati come catalizzatori per la sintesi di molecole organiche ad alto valore aggiunto. Nello specifico, i sistemi basati sulla tirosinasi sono stati usati per la sintesi dei catecoli, molecole con importanti proprieta farmacologiche quali attivita antiossidante e antitumorale. La sintesi dei catecoli e stata effettuata sia in soluzione acquosa che in miscela bifasica usando diclorometano e acqua come solventi. I sistemi basati sulla laccasi sono stati invece impiegati nell'ossidazione di alcoli ad aldeidi in presenza di mediatori molecolari. Entrambi gli enzimi, tirosinasi e laccasi, usano ossigeno molecolare come ossidante pr'mario. I risultati ottenuti dimostrano che le procedure di immobilizzazione aumentano la stabilita degi enzimi alle diverse temperature e pH analizzate, con il sistema LbL che manifesta una maggiore efficienza in tutte le condizioni studiate. lnoltre, sebbene gli enzimi immobilizzati siano caratterizzat' da una minore efficienza catalitica (minore Vmax e maggiore Km), mostrano una reattivita comparabile a quella dell'enzima omogeneo quando sono impiegati nell'ossidazione dei composti organici, conducendo reazioni con alte rese e conversioni di substrato. L'immobilizzazione inoltre permette un facile recupero del catalizzatore dalla miscela di reazione e un suo riciclo per piu processi ossidativi consecutivi. Grazie ai numerosi vantaggi che offrono, gli enzimi immobilizzati si mostrano cosi adatti a possibili applicazioni su scala industriale per la sintesi di numerosi composti bioattivi, rappresentando un'efficiente alternativa ai tradizionali processi di sintesi chimica che si avvalgono di procedure costose e basate sull'utilizzo di composti altamente tossici e inquinanti. IV