Role of Lamin A/C in neuroblastoma differentiation: therapeutic implications

Abstract

Neuroblastoma is one of the most aggressive solid tumors in childhood. The degree of its differentiation can influence patient outcome since high differentiated tumors have been correlated to favourable prognosis. Most neuroblastoma cells maintain the ability to differentiate in vitro in the presence of various agents, rendering them a good model to study the differentiation potential of these tumors. Nuclear lamins are type V intermediate-filament proteins that form a scaffoldlike meshwork underlying the inner nuclear membrane and have many different and not completely known functions. Among lamins, the A-type ones are expressed in differentiated tissues and are involved in the differentiation processes during the embryonal development. Their expression is reduced or absent in different human malignancies even though their role in the tumorigenesis is not yet characterized. Our aim was to investigate the role of Lamin A/C, belonging to A-type lamins, in the differentiation and tumorigenesis of neuroblastoma cells. We have also studied whether Lamin A/C could represent a marker of drug sensitivity, which could contribute to develop therapeutic strategies based on the molecular profile of the individual tumor. As cellular model we employed a neuroblastoma cell line able to differentiate in vitro and showing high expression levels of Lamin A/C, the SHSY5Y cell line. As differentiating stimulus we used the all-trans retinoic acid (RA), the most effective compound which has been shown to induce differentiation in neuroblastoma cells and that is employed as biological agent in clinics to improve patients’ survival. Silencing of Lamin A/C blocked the differentiation processes activated by the RA in SHSY5Y cells, thus preventing the formation of neurites and inhibiting the expression of the tyrosine hydroxylase differentiation marker. The genome-wide gene-expression profiling of SHSY5Y cells silenced for LMNA gene (miRL cells), in the presence or not of the differentiating stimulus confirmed that miRL cells have down-regulated those genes necessary for the differentiation program. As well an increase of tumor progression related genes shifted the SHSY5Y cells phenotype towards a more aggressive one, with a higher resistance elicited versus some chemoterapic agents, thus demonstrating that Lamin A/C could represent a good marker of neuroblastoma tumor progression and of response to antitumoral therapeutics.

Il neuroblastoma è uno dei tumori solidi infantili più aggressivi. Il suo grado di differenziamento può influenzare lo sviluppo della malattia e l’esito clinico poiché più il tumore risulta differenziato più la prognosi è favorevole. La maggior parte delle cellule di neuroblastoma mantiene la capacità di differenziare in vitro in presenza di diversi stimoli e ciò le rende un buon modello per studiare il potenziale differenziativo di tali tumori. Le lamine nucleari sono proteine che appartengono alla classe dei filamenti intermedi di tipo V. Formano una struttura reticolare al di sotto della membrana nucleare interna e svolgono diverse funzioni, alcune delle quali non sono state ancora del tutto chiarite. Tra le lamine, quelle di tipo A sono espresse nei tessuti differenziati e sono coinvolte nei processi differenziativi che avvengono durante lo sviluppo embrionale. La loro espressione risulta ridotta o assente in molti tumori umani, tuttavia non è stato ancora caratterizzato un loro ruolo nei processi di tumorigenesi. Il nostro obiettivo è stato quello di indagare il ruolo della Lamina A/C, appartenente alle lamine di tipo A, nel differenziamento e nella tumorigenesi delle cellule di neuroblastoma. Abbiamo inoltre verificato la possibilità che la Lamina A/C sia un marcatore di sensibilità ai farmaci chemioterapici, in quanto ciò consentirebbe di sviluppare strategie terapeutiche personalizzate sulla base del profilo molecolare del singolo tumore. Come modello cellulare abbiamo utilizzato la linea di neuroblastoma SHSY5Y, che esprime ad alti livelli la Lamina A/C ed è in grado di differenziare in vitro. Abbiamo scelto quale stimolo differenziativo l’acido retinoico (RA), poiché è il composto più efficace nell’indurre il differenziamento delle cellule di neuroblastoma ed è inoltre utilizzato in clinica per aumentare la sopravvivenza dei pazienti affetti da neuroblastoma. Il silenziamento della Lamina A/C nella linea SHSY5Y ha causato un blocco dei processi differenziativi attivati da RA, in quanto risultano inibite sia la formazione dei neuriti che l’espressione del marcatore tirosina idrossilasi. Lo studio del profilo di espressione genica delle cellule SHSY5Y silenzate per il gene LMNA (cellule miRL), in presenza o meno dello stimolo differenziativo, ha confermato una repressione di diversi geni necessari al differenziamento. Le cellule miRL mostrano inoltre un incremento nell’espressione di geni relati alla progressione tumorale che si accompagna ad un fenotipo più aggressivo nonché ad un’aumentata resistenza ad alcuni farmaci chemioterapici. L’espressione della Lamina A/C nel neuroblastoma potrebbe dunque essere un buon marcatore di progressione tumorale e di risposta alla terapia farmacologica.