Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2439
Title: Recombinant production, functional characterization and biotechnological application of fungal oxidoreductases
Other Titles: Produzione ricombinante, caratterizzazione funzionale e applicazioni biotecnologiche di ossidoresuttasi di origine fungina
Authors: Lezzi, Chiara
Keywords: Laccase;Tyrosinase;Recombinant production in S. cerevisiae;Ca-Alginate immobilization;Mutagenesis;Protein engineering;Laccasi;Tirosinasi;Clonaggio;Espressione ricombinante in S. cerevisiae;Immobilizzazione in ca-alginato;Mutagenesi;Ingegneria proteica;BIO/13
Issue Date: 21-Mar-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
The oxido-reductases are enzymes able to catalyze the electron removal from oxidizer to
reducer. Laccase and tyrosinase, multicopper enzymes oxidizing phenolic compounds and
aromatic diamines by using molecular oxygen as the electron acceptor, belong to the
oxido-reductases group. They are enzymes commonly found in plants, fungi, bacteria and
insects. Laccase substrates have large versatility and this makes these enzymes highly
interesting for various biotechnological and industrial applications.
Though laccases and tyrosinases can be directly purified from natural producers, protein
recombinant expression in a suitable host organism is the most profitable procedure to
obtain, industrially, these enzymes in high quantities and with high purity levels.
The presence of oxidative enzyme activities has been also associated to microbial
detoxification of olive mill wastewaters (OMWs) after their treatment with selected
basidio- and asco-mycetes.
The objectives of this study were to characterize genes coding for oxidoreductases in
Basidiomycetes, in particular the ERY3 and ERY4 laccase genes of Pleurotus eryingii and
the PPO2 gene coding for the Agaricus bisporus tyrosinase, and to select non-conventional
yeast able to produce new oxidoreductase enzymes.
The ERY3 gene, coding for a P. eryngii laccase, was isolated, cloned and transformed in
Saccharomyces cerevisiae cells. The production of recombinant laccase was assayed with a
colorimetric test in presence of ABTS, on SDS-PAGE and Western blot analysis.
The recombinant yeasts cells were immobilized in calcium alginate beads and the
immobilization parameters (inoculum, sodium alginate and CaCl2 concentration) were
optimized.
The ERY4 laccase gene of P. eryngii was expressed in S. cerevisiae and the recombinant
laccase resulted to be not biologically active. This gene was thus modified in order to study
the role of its N- and C-terminal regions in determining enzyme catalytic properties. ERY4
gene was subjected to a mutational analysis following these approaches: i) C-terminal
progressive deletion to study the role of specific amino acid residues at the C-terminus of
Ery4 protein, ii) site-directed mutagenesis of the C-terminal region, iii) chimerical laccases
derived from the substitution of both its terminal regions with the corresponding regions of
ERY3 gene. The fourteen recombinant genes were separately expressed in S. cerevisiae.
2
Almost all mutant recombinant isoforms showed that they possess enzymatic activity and
affinities for different substrates.
Genes encoding the laccase isoforms which showed the best enzymatic performances on
different substrates, were expressed in S. cerevisiae by displaying the recombinant enzyme
on yeast cell surface. The biochemical characterization, immunodetection and Western blot
analysis of displayed proteins were performed. To our knowledge, this is the first example
of a functional laccase immobilized on yeast surface.
The PPO2 tyrosinase gene of Agaricus bisporus was expressed in S. cerevisiae cells and
the produced protein was purified by using affinity chromatography and biochemically
characterized. To our knowledge, this is the first time that an A. bisporus tyrosinase was
expressed in heterologous host S. cerevisiae and in biologically active form.
In order to select, from biotechnologically relevant habitat, microorganisms producing
oxidoreductases, the effluents from 5 different local olive mills were collected. Three
hundred isolates were identified according to their rDNA sequence. Twelve on the 300
identified isolates, belonging to Candida membranifaciens, C. tropicalis, Geotricum
candidum, Pichia fermentans, P. holstii and S. cerevisiae species, demonstrated that they
were able to use OMW as unique nutrient source for their growth. Phenolic compound
concentration and antimicrobial activity was rapidly and significantly decreased by the G.
candidum strains. The physiological properties of the described G. candidum isolates
confirmed the potential of these yeasts to produce a wide range of extracellular enzymes.
One of the selected G. candidum strains was chosen as a model to set up an immobilized
system of viable cells for mill waste bioremediation. Concentration of G. candidum as free
cells in the medium, the COD values, the concentration of phenolic compounds, the
medium decolourization and the antimicrobial activity were measured at estabished
interval times for both immobilized and free G. candidum biomasses. Indeed, the COD
removal and phenolics degradation by calcium alginate entrapped cells were higher than
those of free cells, because the immobilization dramatically reduces the extracellular
protease(s) activity, thus increasing the stability of microbial secreted oxidases.

L’avvento delle biotecnologie ha consentito di produrre grandi quantitativi di enzimi ad
elevati livelli di purezza da utilizzare in diversi processi industriali. Questa potenzialità ha
permesso di aumentare l’efficienza delle reazioni, ridurre i costi di produzione ed i prodotti
reflui di lavorazione. Le ossidasi, in particolare laccasi e tirosinasi, sono enzimi ubiquitari
che trovano applicazioni biotecnologiche in ambito biomedico, farmaceutico, cosmetico,
industriale ed ambientale.
Scopo di questo progetto di ricerca è l’isolamento, la caratterizzazione funzionale di
laccasi e tirosinasi di origine fungina, l’espressione di tali proteine in forma ricombinante e
lo sviluppo di loro potenziali applicazioni in ambito biotecnologico ed industriale.
Per quanto riguarda le laccasi da basidiomiceti, il gene ERY3 codificante un’isoforma di
laccasi, è stato isolato dal fungo basidiomicete Pleurotus eryngii, ed è stato espresso in
forma eterologa e funzionalmente attiva nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Inoltre, è
stata ottimizzata una procedura di immobilizzazione delle cellule di lievito ricombinanti in
sferette di calcio alginato.
Il gene ERY4 di P. eryngii, codificante una laccasi, è stato espresso in forma ricombinante
in S. cerevisiae, ma la proteina prodotta si è dimostrata non biologicamente attiva. Il gene
ERY4 è stato sottoposto ad un’analisi mutazionale secondo i tre seguenti approcci: i)
delezione progressiva della parte C-terminale della proteina codificata, ii) mutagenesi
puntiforme della medesima regione, iii) sostituzione nelle porzioni N e C terminale della
laccasi Ery4 con le equivalenti regioni dell’isoforma Ery3. I geni ricombinanti sono stati
espressi in S. cerevisiae. Le laccasi ricombinanti prodotte hanno mostrato di possedere,
nella quasi totalità, attività enzimatica e peculiari affinità per una serie di differenti
substrati.
Due delle isoforme mutanti prodotte sono state immobilizzate sulla superficie esterna delle
cellule di lievito mediante fusione con proteine endogene di parete. Le proteine
immobilizzate sono state caratterizzate da un punto di vista biochimico e visualizzate
correttamente sulla superficie esterna delle cellule ricombinanti di lievito.
La tirosinasi Ppo2 di Agaricus bisporus è stata prodotta nel lievito S. cerevisiae, purificata
mediante cromatografia di affinità e caratterizzata biochimicamente. Secondo quanto
riportato in letteratura, questa è la prima espressione di una tirosinasi di origine fungina nel
lievito S. cerevisae in forma biologicamente attiva.
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Allo scopo di isolare microorganismi produttori di ossido reduttasi da nicchie ecologiche di
interese biotecnologico, sono stati prelevati dei campioni di acque reflue di lavorazione
(OMW) da cinque differenti oleifici del Salento (Puglia). E’ stata isolata la popolazione
microbica (lieviti e muffe) e un campione della stessa è stato identificato molecolarmente. I
lieviti sono stati selezionati sulla base della loro capacità di usare le OMW come unica
fonte di nutrimento. Un ceppo di Geotricum candidum, utilizzato per fermentare un
campione di OMW, ha mostrato la capacità di ridurre significativamente la concentrazione
dei composti fenolici e l’attività antimicrobica dello stesso. Il ceppo di G. candidum è stato
utilizzato per la messa a punto di un sistema di immobilizzazione di cellule vive per la
riduzione dell’impatto ambientale dei reflui oleari. La rimozione della COD e la
degradazione dei fenoli risulta più elevata per le cellule immobilizzate rispetto alle stesse
in forma libera, perché l’immobilizzazione riduce notevolmente la presenza di proteasi
extracellulari, aumentando così la stabilità delle ossidasi microbiche.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2439
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