Applicazione di tecniche molecolari avanzate nel miglioramento genetico del pesco (Prunus persica(L.) Batsch) per i caratteri legati alla qualità del frutto

Abstract

Poche specie da frutto si sono diffuse così rapidamente nel mondo adattandosi a molteplici ambienti come il pesco [Prunus persica (L.) Batsch] diventando una della colture più importanti, la cui produzione mondiale raggiunge i 15 milioni di tonnellate all’anno superata solo da quella del melo (62 milioni di tonnellata). L’attività di miglioramento genetico, dalla fine del ‘900 agli anni novanta, si è focalizzata sull’ottenimento di varietà altamente produttive, di elevata pezzatura, di bell’aspetto, ma spesso insapori che potessero resistere alle manipolazioni, caratteristiche che soddisfano più i rivenditori che i consumatori. L’obiettivo odierno è quello di ottenere produzioni con elevate caratteristiche organolettiche e crescenti standard di salubrità sia per il consumatore sia per l’ambiente. La maturazione del frutto è un processo complesso e geneticamente programmato che culmina con dei drastici cambiamenti per quello che riguarda la tessitura, il colore, l’aroma ed il sapore della polpa. Questi cambiamenti sono dovuti alla distruzione enzimatica della parete cellulare, all’idrolisi dell’amido, all’accumulo di zuccheri e alla scomparsa di acidi organici e di composti fenolici. A causa dell’importanza economica che questi eventi hanno sulla conservabilità e trasportabilità del frutto, negli anni sono stati oggetto di studio dal punto di vista biochimico e genetico. In pesco si distinguono tre differenti tipologie di polpa: il fenotipo fondente (melting flesh) è associato ad un elevato incremento delle pectine solubili che coincide con una drastica di perdita di consistenza; il fenotipo croccante (non-melting flesh) in cui le pectine sono sottoposte ad una depolimerizzazione minima e quindi i frutti rimangono relativamente consistenti anche in piena maturazione; ed infine il fenotipo ‘stony hard’, questa tipologia di pesche ha la caratteristica di avere una polpa estremamente consistente a causa della mancata sintesi dell’etilene. L’obiettivo principale di questo dottorato di ricerca è stato quello di individuare ed analizzare i caratteri monogenici e poligenici che concorrono a determinare la qualità del frutto; con particolare riferimento al carattere “stony hard”. Durante questa ricerca sono stati raggiunti diversi risultati. E’ stata costruita una mappa d’associazione (O’H x Y, Yumyeong portatore carattere ‘stony hard’), anche se parziale, all’interno della quale sono stati localizzati due caratteri morfologici strettamente legati alla qualità del frutto. Il colore della polpa e l’aderenza della polpa al nocciolo. Sono stati, inoltre, collocati cinque nuovi loci SSR che potranno essere utilizzati come ancore in altre mappe d’associazione all’interno del genere Prunus. E’ stata confermata l’associazione fra il carattere aderenza della polpa e il marcatore endoPG1, recentemente pubblicato (Peace et al. 2005). Analizzando bulk composti da individui con fenotipo ‘stony hard’, è stato individuato un frammento RAPD, OPN91100, che sembra essere associato con il carattere in esame. Questo risultato, quando validato, potrà essere un utile strumento nei programmi di miglioramento genetico per la selezione e la valutazione precoce dei semenzali. Sono state prodotte 1500 EST da mesocarpo di frutto, a maturazione fisiologica della cultivar Yumyeong. Utilizzando le sequenze microsatelliti presenti all’interno delle EST sono stati disegnati e caratterizzati 26 loci SSR. Questi marcatori hanno dato luogo ad amplificazioni in differenti specie del genere Prunus ed hanno evidenziato dei polimorfismi nei parentali di tre popolazioni segreganti (Texas, EarlyGold, F1 T x E; P. ferganensis, IF7310828, F1 P x F; O’Henry, Yumyeong, F1 O’H x Y). Questi nuovi SSR potranno essere utilizzati da tutti coloro che operano studi genetici all’interno del genere. Infine è stato confermato, a livello molecolare, ciò che era stato evidenziato da Haji et al. (2001), per via chimica. La cultivar Yumyeong, con fenotipo ‘stony hard’, non produce etilene ed è questa deficienza che le conferisce una peculiare croccantezza della polpa. L’individuazione, all’interno delle EST, ottenute a partire dalla cv Yumyeong, di alcune sequenze omologhe alla porzione codificante dell’enzima ACC ossidasi ha confermato che questo enzima chiave della via biosintetica dell’etilene, è funzionale. Questa evidenza ha permesso di affermare che lo stop nella via biosintetica è probabilmente dovuto a modificazioni della regione promotrice del gene Aco o a mutazioni in uno dei passaggi a monte della sintesi. In conclusione, un’importante risultato, anche se ancora da validare, riguarda due caratteri correlati con la qualità del frutto: la consistenza della polpa e l’aderenza della polpa al nocciolo. Si è evidenziato che questi due caratteri, pur dipendendo dallo stesso gene (endopoligalatturonasi), hanno una sensibilità diversa all’etilene; avvallando l’ipotesi di più copie del gene nella medesima regione del genoma. Il carattere aderenza della polpa sembra essere etilene indipendente, poiché all’interno della popolazione analizzata (O’H x Y), evidenzia una segregazione di tipo indipendente rispetto al carattere ‘stony hard’ (c = 2,2, non significativo; gl 3).

Peach [Prunus persica (L.) Batsch] is a temperate fruit species of economic importance. It ranks second in fruit production in Europe after apple. Consumers are more and more aware of the quality of the fruit, increasing attention to characteristics like taste, flavor and nutritional properties. For these reasons, improvement of fruit quality is one of the target of breeding programs. Many different traits are involved in fruit quality, one of the most important is the flesh firmness. This character effect the handling and shipping times as well as the resulting shelf life of the fruit. In peach three different type of flesh are reported: melting flesh (fresh market type, MF), non-melting flesh (canning type, NMF) and stony hard flesh (hd). The MF/NMF trait depends on the expression of endoPG gene and the hd/hd trait is due to the lack of ethylene production. In this work molecular approaches were utilized to investigate some of the traits that are involved in fruit quality. With this aim a genetic linkage map was obtained from a F2 progeny (O’Henry x Yumyeong; Yumyeong is a stony hard peach). The map is composed of 110 molecular and morphological markers (flesh colour, Y; adhesion of the endocarp, F; 21 SSR; 86 AFLP; 1 GTM) covering 635 cM with an average distance of 5.8 cM. Sixteen linkage groups were assembled instead of the 8 expected for peach (x = 8), because of problems due to the population. Five new SSR, never mapped in Prunus, were placed. The co-segregation between the F locus and the endoPG marker, previously published (Peace et al., 2005), were confirmed. Moreover Bulked Segregant Analysis was performed with RAPD marker. Two bulked DNA samples were generated , in duplicate, from a segregating population from ‘stony hard’ trait. Each pool, or bulk, contains individuals that are identical for this particular trait but arbitrary at all unlinked regions. 296 RAPD primers were tested within bulks, only one fragment, OPN91100, seems to be associated with the trait. If this preliminary result will be validated, should provide an efficient tool for marker assisted selection (MAS). Finally a set of 1500 EST derived from fruit mesocarp (cv Yumyeong, ripening stage S4) were analyzed looking for genes involved in softening of flesh. About 7.6% of the assembled ESTs contained SSRs. Out of these 26 SSR marker were characterized in 5 species of Prunus genus and in the parents of 3 segregant populations (T x E, P x F, O’H x Y) The microsatellite produced 1–7 alleles per locus, the average values of observed and expected heterozygosities among the 26 SSR loci were 0.27 and 0.25, respectively. Inside the EST set, from Yumyeong mesocarp, a little amount of sequences related to the ACC oxidase (ACO) were found. The ACC oxidase is the key enzyme in the biosynthetic pathway of Ethylene, the most important hormone involved in fruit ripening. The rate of EST related to Aco is less than half if compared with other EST set from peach mesocarp. To validate this evidence a northern analysis was performed on the RNA from mesocarp of cv. Yumyeong and cv. Françoise (as positive control), with the 3’UTR of Aco gene and 3’UTR endoPG gene as a probe. Yumyeong showed undetectable levels of endoPG trascript and a significantly reduced amounts of ACO mRNA. This result is consistent with the evidences reported in ‘stony hard’ peaches (Haji et al., 2001). A preliminary evidence gives new insights on the genetic control of freestone and melting flesh characters. This traits depend on the same locus (Peace et al., 2005). The segregation data, in O’H x Y progeny, shown an independent segregation between freestone and stony hard traits (c2 = 2,2; no significant fd 3). This result highlights that freestone trait is independent of ethylene, contrary to melting flesh trait. Probably in the F locus there was different copies on endoPG gene with different promoters that shown differential sensitivity to ethylene.