Understanding temperature-related physiological processes through proteomics in vegetal and animal systems

Abstract

Proteomics, the large-scale study of proteins present in a cell, was born and developed with the basic aim of broaden the current knowledge about the relationship between proteins and the main biological processes presiding over life of organisms. Due to its instrinsic ability to observe all protein variations in a biological system in response to different stimuli at once, proteomics could be resembled to a translator, which converts the language of nature in a network of protein interactions. The main effort consists in the assembly of the information here obtained to discover the main factors responsible for these protein variations. The present work describes several proteomic applications to the characterization of temperature-related phenomenons. Biological systems, belonging both to vegetal and animal kingdom, were subjected to diverse treatments and their protein modulations were observed in function of time. The first objective of my PhD was the study of the influence of prolonged cold treatment on the expression of cold-induced proteins in a vernalized common wheat (Triticum aestivum L.), to identify proteomic changes in vernalization-treated plants when the key steps in controlling the flowering time occur. Leaf proteome of cold acclimated and vernalized winter wheat were compared with the control non acclimated ones grown at control temperature of 20 °C. Total protein was extracted from the leaves of cold treated or control plants, then separated by 2- dimensional electrophoresis. The identities of differentially expressed proteins were determined by tandem mass spectrometry. My second objective was the application of proteomics to delve into plant cross-tolerance to different abiotic stresses. In particular, we focussed on cold and drought stressors; with the attempt to shed light into those metabolic modulations strictly related to exposure to low temperatures, we choose a drought-resistant spring wheat variety for our proteomic study so to minimize the dehydrative component of cold stress. Finally, in the last year of my PhD, I joined a project concerning platelet quality assessment through proteomic approach. The aim of my work was to analyze proteomic changes occurring in platelet concentrates (PCs), in function of time. We used proteomic approach to detect changes in PC supernatants (obtained after brief centrifugation of PCs) after 0, 4 and 7 days of storage at 22°C. To achieve a more complete overview of the pr otein pool accumulating/dissapearing in this sub-proteome, we made use of ProteoMinerTM technology to enrich our final proteome for the lowabundance species, often hidden by high abundant ones (in our case mainly plasma albumin). The commonality of such different topics was double. First, proteomic approach was applied almost in the same manner (with proper but minor modifications in the extraction protocols); second, the general attempt was to achieve a greater understanding of different processes influenced by temperature through their monitoring over time.

La proteomica, lo studio dell’intero corredo proteico di una cellula, è nata e si è sviluppata negli anni con lo scopo di ampliare la nostra conoscenza sulle relazioni intercorrenti tra le proteine e i principali processi legati alla vita degli organismi. Per la sua peculiare capacità di osservare simultaneamente tutte le variazioni a carico delle proteine di un sistema biologico in risposta a svariati stimoli, la proteomica potrebbe essere paragonata ad un traduttore, che converte il linguaggio, a noi in gran parte ignoto, della natura, in una rete di interazioni composta da proteine, più leggibile e interpretabile dall’uomo. Lo sforzo maggiore consiste nel riunire tutte le informazioni ricavate dall’approccio proteomico ed interpretarle allo scopo di comprendere i fenomeni che presiedono alle variazioni osservate. Il presente lavoro di tesi descrive l’applicazione della proteomica alla caratterizzazione di fenomeni influenzati dalla temperatura; i sistemi biologici presi in esame, appartenenti al mondo vegetale e animale, sono stati sottoposti a diversi trattamenti, e loro variazioni proteiche sono state osservate nel tempo. Il primo obiettivo del mio dottorato è stato lo studio dell’influenza di una prolungata esposizione alle basse temperature sull’espressione di proteine correlate al freddo in una varietà comune di grano invernale (Triticum aestivum L.), allo scopo di identificare cambiamenti a livello del proteoma. Il proteoma fogliare di grano vernalizzato è stato messo a confronto con controlli non esposti al freddo ma cresciuti a 20°C. Il proteoma totale è st ato estratto e separato tramite elettroforesi bidimensionale (2D-E). L’utilizzo delle tecniche di spettrometria di massa ha poi permesso di determinare l’identità delle proteine differenzialmente espresse. Il mio secondo obiettivo è stato l’approfondimento della cross-tolleranza a diversi stress abiotici nelle piante. In particolare, gli stress analizzati sono stati il freddo e la siccità; è stata scelta a tale scopo una varietà di grano primaverile sensibile al freddo ma tollerante alla siccità. Infine, durante il mio terzo anno di dottorato, sono stata coinvolta in un progetto di ricerca che aveva come scopo la determinazione della qualità di concentrati piastrinici ad uso sanitario dopo stoccaggio per 7 giorni a 22°C, pratica in uso pres so gli istituti ospedalieri. Per ottenere un quadro più completo del pool di proteine differenzialmente espresse durante lo storage, è stato introdotto tra l’estrazione proteica e la separazione elettroforetica uno step di arricchimento del proteoma a bassa abbondanza (ProteoMiner Kit). L’aspetto comune di queste tematiche apparentemente così diverse e lontane è stato l’approccio sperimentale, seguito quasi specularmente nei tre campioni biologici. Inoltre, l’obiettivo è stato, in tutti i casi presi in esame, quello di approfondire i meccanismi attraverso i quali la temperatura esercita un controllo sui sistemi biologici, attraverso il loro monitoraggio nel tempo.