Advanced biophysical approaches to nano-bio-sensing: potential environmental and biomedical applications based on p53-azurin interaction

Abstract

The availability of advanced methodologies, especially suited for sensitive and reliable screening of indicators of both environmental and human pathologies, is a crucial element for an effective early detection. For this reason, nanoscience and nanotechnology research combines efforts to improve environmental and biomedical diagnostic, often resorting to advanced biophysical approaches which have the potential to overcome detection limits of traditional methods. In particular, signal amplification methods, such as Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) and Surface Plasmon Resonance (SPR), are now entrenching in modern environmental and biomedical fields. By taking advantage of the peculiar optical properties of metal structures at the nanoscale, in fact, they offer the possibility of developing ultrasensitive nano-bio affinity assays. Given the importance of health and safety in human society, considerable resources have been and are being expended in efforts to identify and classify human carcinogens, in order to reduce the risk of cancer. As the tumour suppressor protein p53 is directly involved in the chain of biochemical events that follow genotoxic damage, some researchers have tried to incorporate this information into testing protocols, evidencing a close correlation between the DNA damaging mechanism and the p53 induction pattern of a given chemical. Hence, p53 has a huge potential as a biological indicator of environmental conditions which threaten human health, and the novel biophysical approaches offer the adequate features to turn such p53 potential into novel, more accurate, quick and efficient methods to early screen substances for carcinogenicity. In this connection, we have explored the analytical potential of advanced biophysical methods in an attempt to more deeply understand the improvement they can provide to traditional bio-affinity assays; successively, by means of these approaches, we have tried to reduce the detection threshold of the tumour marker p53. To probe the presence of p53, we have used the blue copper protein Azurin (Az), whose physical interaction with the tumour suppressor has been recently proposed in connection with its demonstrated anticancer activity. By SPR, we have analysed the Az-p53 binding kinetics and ascertained the strong stability of their specific interaction even in presence of the protein Mdm2, which is one of the main regulators of p53; then we have exploited the specific interaction between Az and p53 to realize a novel SERS-based immunoassay detection method, made up by the synergic combination of SERS methodology and bioaffinity assays. In this way it has been possible to strongly reduce the current detection limit for p53 down to levels which are appealing also for screening in human serum. The importance of investigating the Az-p53 interaction is not limited to analytical detection aspects. Indeed our SPR measurements performed on the proteins p53, Mdm2 and Az indicate that these three proteins are likely engaged in a ternary structure where the interaction of Az with p53 modulates the Mdm2-p53 binding kinetics. Since the tumour repression activity of p53 is mainly down-regulated by Mdm2, the latter result could provide an useful insight into the possibility of designing new anticancer drugs.

I recenti progressi nanoscientifici e tecnologici permettono oggi l’impiego di metodologie biofisiche avanzate ad elevato potenziale analitico in campo ambientale e biomedico. Infatti i peculiari fenomeni fisici che operano su scala nanometrica (per questo detti a campo vicino) possono essere rilevati e controllati per aumentare sensibilità e accuratezza diagnostica molecolare e di conseguenza il livello d’informazione utile nella prevenzione e cura di patologie umane e ambientali. Particolare attenzione rivestono le metodologie ottiche di amplificazione di segnale basate sull’impiego dei plasmoni di superficie. La risonanza plasmonica superficiale (SPR) è una oscillazione della densità di carica indotta da una radiazione elettromagnetica che può aver luogo su superfici metalliche a contatto con un dielettrico costituito ad esempio da molecole organiche e proteine. La capacità di assemblare nanostrutture metalliche e molecole ha permesso di utilizzare le intense bande di diffusione e assorbimento, prodotte dai plasmoni di superficie sotto opportune condizioni di irraggiamento elettromagnetico, per trasformare tradizionali tecniche strumentali, quali la spettrofotometria Raman e di assorbimento UV-Visibile, in metodologie ultrasensibili note con il nome di Surface- Enhanced Raman Scattering (SERS) e Surface Plasmon Resonance (SPR). La metodologia SERS sfrutta l’enorme incremento della sezione d’urto Raman (che può raggiungere un fattore 1010) subito da un analita quando sottoposto al forte campo elettromagnetico e al trasferimento di carica indotti dalla adiacente presenza di opportune nanostrutture metalliche irraggiate, quali nanoparticelle d’oro e argento. La tecnologia SPR sfrutta invece l’eccitazione ottica dei plasmoni di superficie prodotta in opportune strutture planari, la cui energia di risonanza risulta altamente sensibile solo nell’intorno dielettrico a distanze nanometriche dalla superficie di eccitazione. Questo ha permesso di sviluppare una nuova tecnologia che consente di monitorare in tempo reale e quindi di acquisire accurate informazioni cinetiche e di equilibrio su complessi biologici con rilevanza biomedica e ambientale.Recenti lavori hanno messo in luce la possibilità di coniugare i vantaggi di queste metodologie nanoscientifiche con quelli dei metodi bioanalitici basati sul riconoscimento molecolare specifico e selettivo, quali il tradizionale metodo ELISA, al fine di ottenere nuovi e più efficaci approcci bioanalitici. A tale scopo, abbiamo considerato l’interazione fisica e funzionale tra la proteina umana p53 e la proteina batterica a trasferimento elettronico Azzurrina. p53, descritto come “il guardiano del genoma”, rappresenta uno dei fattori di trascrizione più studiati con attività di repressore tumorale. In condizioni cellulari normali, la sua concentrazione e attività tumorale sono inibite principalmente mediante un meccanismo di regolazione mediato dall’interazione di p53 con l’ubiquitina ligasi Mdm2. In presenza di danni del DNA indotti da fattori chimico-fisici ambientali e biologici, p53 viene stabilizzato e attivato inibendo l’interazione con Mdm2, permettendo così l’espressione dei suoi geni target preposti alla riparazione del danno o all’apoptosi. p53 è direttamente coinvolto nella catena dei processi biochimici scaturiti da un danno al DNA e riveste quindi un ruolo importante come potenziale bioindicatore in grado di discriminare la presenza di alcuni agenti genotossici e patologie tumorali. p53 riveste anche un ruolo centrale nella realizzazione di nuovi farmaci in grado di stimolare la sua attività antitumorale. Riguardo quest’ultimo aspetto è stato recentemente dimostrato che Azzurrina, membro della famiglia delle “blue copper protein”, può essere internalizzata preferenzialmente in cellule tumorali, dove induce apoptosi con efficacia verificata in vitro e in vivo. L’azione apoptotica di Azzurrina (Az) è concomitante alla formazione di un complesso con p53, che porta alla stabilizzazione di quest’ultimo, agendo quindi in apparente opposizione rispetto all’azione di down-regolazione indotta dal legame Mdm2-p53. Studi molecolari hanno evidenziato che l’interazione tra Az e p53 è stabile ma fino ad oggi le caratteristiche stereochimiche e cinetiche di tale interazione non sono state completamente chiarite, pur essendo importanti per la comprensione del meccanismo anticancro di Azzurrina. Partendo da questi concetti, in questo lavoro abbiamo sfruttato le potenzialità analitiche di questa interazione per la rilevazione ultrasensibile di p53 mediante un nuovo metodo nanobio- sensoriale basato sul fenomeno SERS e supportato anche dalla spettrofotometria UVVisibile e dai metodi a scansione di forza quali la Microscopia a Forza Atomica (AFM). In particolare abbiamo analizzato l’intenso segnale SERS prodotto dalla coniugazione covalente di p53 e nanoparticelle d’oro (Np) utilizzando come linker il marcatore Raman para-amminotiofenolo (4-ATP), già impiegato con successo nella realizzazione di “substrati SERS”. Abbiamo quindi realizzato un substrato di cattura, utilizzando Azzurrina come proteina partner, sul quale abbiamo incubato il sistema p53-(4-ATP-Np) in condizioni fisiologiche. Seguendo le bande SERS caratteristiche del sistema p53-(4-ATPNp), legato all’Azzurina, abbiamo rilevato p53 inizialmente presente a concentrazioni subpicomolari, mettendo in evidenza che la metodologia utilizzata è ultrasensibile, rapida e di ampio respiro in ambito diagnostico. Utilizzando la tecnologia SPR abbiamo studiato l’interazione Az-p53, rilevando i corrispondenti parametri cinetici e di affinità. Inoltre, allo scopo di fornire nuove informazioni riguardo al meccanismo di stabilizzazione di p53 in cellule tumorali, abbiamo valutato l’effetto della presenza di Azzurrina sull’interazione funzionale Mdm2-p53, utilizzando strutture proteiche intere nel loro corretto folding nativo. A tale scopo, abbiamo estratto le costanti di velocità di reazione dei complessi Mdm2-p53 e Az-p53, e li abbiamo comparati con quelle ottenute dall'interazione tra Azzurrina ed il preformato complesso Mdm2-p53, e tra Mdm2 ed il preformato complesso Az-p53. L’analisi ha rivelato che Azzurrina può legare p53 in maniera specifica e stabile senza subire variazioni cinetiche e di affinità significative anche in presenza di Mdm2, suggerendo quindi che Azzurrina ed Mdm2 non interagiscono con la stessa regione di p53. Questo risultato è stato confermato anche mediante studi competitivi eseguiti a livello di singola molecola utilizzando la Spettroscopia a Forza Atomica (AFS). Nonostante il sito di legame per p53 non sia lo stesso, quando Azzurrina lega p53 l'interazione tra Mdm2 e p53 viene significativamente influenzata poiché la costante di velocità di associazione tra le due proteine viene ridotta di più di 4 volte. Questo significa che Azzurrina può esercitare un’azione d’inibizione parziale del legame Mdm2-p53 attraverso un meccanismo a distanza che implica la formazione di un legame Az-p53 che può essere localizzato o sul dominio N-terminale di p53 ma in posizione distinta da quella preposta per l’interazione con Mdm2, oppure sul suo “DNA-binding domain” (DBD), come predetto da recenti lavori computazionali. Inoltre sono state eseguite misure di dicroismo circolare allo scopo di verificare eventuali modificazioni strutturali indotte da Azzurrina sulla struttura di p53. Quest’indagine ha infatti evidenziato che p53 in presenza di Az è soggetta ad un aumento del 10% del folding secondario nativo. Ciò fa pensare che il meccanismo d’inibizione possa essere di tipo allosterico e suggerisce interessanti prospettive per la progettazione di farmaci in grado di riattivare le funzioni di repressore tumorale di p53, ad esempio nei tumori che sovraesprimendo Mdm2 mantengono inibita l’attività di p53. Alla luce dei risultati ottenuti in questo lavoro, che hanno una rilevanza sia in campo diagnostico che terapeutico, crediamo che l’approccio nanoscientifico per la ricerca di analiti a bassissime concentrazioni possa realmente costituire uno strumento a tutela della salute umana.