Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2417
Title: Advanced biophysical approaches to nano-bio-sensing: potential environmental and biomedical applications based on p53-azurin interaction
Other Titles: Metodi biofisici avanzati per la nano-bio-rivelazione: applicazioni di potenziale interesse biomedico e ambientale basate sull’interazione azzurrina-p53.
Authors: Domenici, Fabio
Keywords: p53;Azurin;SERS;SPR;Tumour marker;Azzurrina;Marcatore tumorale;FIS/07
Issue Date: 18-Jul-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
The availability of advanced methodologies, especially suited for sensitive and reliable
screening of indicators of both environmental and human pathologies, is a crucial element
for an effective early detection. For this reason, nanoscience and nanotechnology research
combines efforts to improve environmental and biomedical diagnostic, often resorting to
advanced biophysical approaches which have the potential to overcome detection limits of
traditional methods. In particular, signal amplification methods, such as Surface-Enhanced
Raman Scattering (SERS) and Surface Plasmon Resonance (SPR), are now entrenching in
modern environmental and biomedical fields. By taking advantage of the peculiar optical
properties of metal structures at the nanoscale, in fact, they offer the possibility of
developing ultrasensitive nano-bio affinity assays.
Given the importance of health and safety in human society, considerable resources have
been and are being expended in efforts to identify and classify human carcinogens, in order
to reduce the risk of cancer. As the tumour suppressor protein p53 is directly involved in
the chain of biochemical events that follow genotoxic damage, some researchers have tried
to incorporate this information into testing protocols, evidencing a close correlation
between the DNA damaging mechanism and the p53 induction pattern of a given chemical.
Hence, p53 has a huge potential as a biological indicator of environmental conditions
which threaten human health, and the novel biophysical approaches offer the adequate
features to turn such p53 potential into novel, more accurate, quick and efficient methods
to early screen substances for carcinogenicity.
In this connection, we have explored the analytical potential of advanced biophysical
methods in an attempt to more deeply understand the improvement they can provide to
traditional bio-affinity assays; successively, by means of these approaches, we have tried to
reduce the detection threshold of the tumour marker p53.
To probe the presence of p53, we have used the blue copper protein Azurin (Az), whose
physical interaction with the tumour suppressor has been recently proposed in connection
with its demonstrated anticancer activity. By SPR, we have analysed the Az-p53 binding
kinetics and ascertained the strong stability of their specific interaction even in presence of
the protein Mdm2, which is one of the main regulators of p53; then we have exploited the
specific interaction between Az and p53 to realize a novel SERS-based immunoassay
detection method, made up by the synergic combination of SERS methodology and
bioaffinity assays. In this way it has been possible to strongly reduce the current detection
limit for p53 down to levels which are appealing also for screening in human serum.
The importance of investigating the Az-p53 interaction is not limited to analytical
detection aspects. Indeed our SPR measurements performed on the proteins p53, Mdm2
and Az indicate that these three proteins are likely engaged in a ternary structure where the
interaction of Az with p53 modulates the Mdm2-p53 binding kinetics. Since the tumour
repression activity of p53 is mainly down-regulated by Mdm2, the latter result could
provide an useful insight into the possibility of designing new anticancer drugs.

I recenti progressi nanoscientifici e tecnologici permettono oggi l’impiego di metodologie
biofisiche avanzate ad elevato potenziale analitico in campo ambientale e biomedico.
Infatti i peculiari fenomeni fisici che operano su scala nanometrica (per questo detti a
campo vicino) possono essere rilevati e controllati per aumentare sensibilità e accuratezza
diagnostica molecolare e di conseguenza il livello d’informazione utile nella prevenzione e
cura di patologie umane e ambientali.
Particolare attenzione rivestono le metodologie ottiche di amplificazione di segnale basate
sull’impiego dei plasmoni di superficie. La risonanza plasmonica superficiale (SPR) è una
oscillazione della densità di carica indotta da una radiazione elettromagnetica che può aver
luogo su superfici metalliche a contatto con un dielettrico costituito ad esempio da
molecole organiche e proteine. La capacità di assemblare nanostrutture metalliche e
molecole ha permesso di utilizzare le intense bande di diffusione e assorbimento, prodotte
dai plasmoni di superficie sotto opportune condizioni di irraggiamento elettromagnetico,
per trasformare tradizionali tecniche strumentali, quali la spettrofotometria Raman e di
assorbimento UV-Visibile, in metodologie ultrasensibili note con il nome di Surface-
Enhanced Raman Scattering (SERS) e Surface Plasmon Resonance (SPR).
La metodologia SERS sfrutta l’enorme incremento della sezione d’urto Raman (che può
raggiungere un fattore 1010) subito da un analita quando sottoposto al forte campo
elettromagnetico e al trasferimento di carica indotti dalla adiacente presenza di opportune
nanostrutture metalliche irraggiate, quali nanoparticelle d’oro e argento.
La tecnologia SPR sfrutta invece l’eccitazione ottica dei plasmoni di superficie prodotta in
opportune strutture planari, la cui energia di risonanza risulta altamente sensibile solo
nell’intorno dielettrico a distanze nanometriche dalla superficie di eccitazione. Questo ha
permesso di sviluppare una nuova tecnologia che consente di monitorare in tempo reale e
quindi di acquisire accurate informazioni cinetiche e di equilibrio su complessi biologici
con rilevanza biomedica e ambientale.Recenti lavori hanno messo in luce la possibilità di coniugare i vantaggi di queste
metodologie nanoscientifiche con quelli dei metodi bioanalitici basati sul riconoscimento
molecolare specifico e selettivo, quali il tradizionale metodo ELISA, al fine di ottenere
nuovi e più efficaci approcci bioanalitici.
A tale scopo, abbiamo considerato l’interazione fisica e funzionale tra la proteina umana
p53 e la proteina batterica a trasferimento elettronico Azzurrina.
p53, descritto come “il guardiano del genoma”, rappresenta uno dei fattori di trascrizione
più studiati con attività di repressore tumorale. In condizioni cellulari normali, la sua
concentrazione e attività tumorale sono inibite principalmente mediante un meccanismo di
regolazione mediato dall’interazione di p53 con l’ubiquitina ligasi Mdm2. In presenza di
danni del DNA indotti da fattori chimico-fisici ambientali e biologici, p53 viene
stabilizzato e attivato inibendo l’interazione con Mdm2, permettendo così l’espressione dei
suoi geni target preposti alla riparazione del danno o all’apoptosi. p53 è direttamente
coinvolto nella catena dei processi biochimici scaturiti da un danno al DNA e riveste
quindi un ruolo importante come potenziale bioindicatore in grado di discriminare la
presenza di alcuni agenti genotossici e patologie tumorali. p53 riveste anche un ruolo
centrale nella realizzazione di nuovi farmaci in grado di stimolare la sua attività
antitumorale.
Riguardo quest’ultimo aspetto è stato recentemente dimostrato che Azzurrina, membro
della famiglia delle “blue copper protein”, può essere internalizzata preferenzialmente in
cellule tumorali, dove induce apoptosi con efficacia verificata in vitro e in vivo. L’azione
apoptotica di Azzurrina (Az) è concomitante alla formazione di un complesso con p53, che
porta alla stabilizzazione di quest’ultimo, agendo quindi in apparente opposizione rispetto
all’azione di down-regolazione indotta dal legame Mdm2-p53. Studi molecolari hanno
evidenziato che l’interazione tra Az e p53 è stabile ma fino ad oggi le caratteristiche
stereochimiche e cinetiche di tale interazione non sono state completamente chiarite, pur
essendo importanti per la comprensione del meccanismo anticancro di Azzurrina.
Partendo da questi concetti, in questo lavoro abbiamo sfruttato le potenzialità analitiche di
questa interazione per la rilevazione ultrasensibile di p53 mediante un nuovo metodo nanobio-
sensoriale basato sul fenomeno SERS e supportato anche dalla spettrofotometria UVVisibile
e dai metodi a scansione di forza quali la Microscopia a Forza Atomica (AFM). In
particolare abbiamo analizzato l’intenso segnale SERS prodotto dalla coniugazione
covalente di p53 e nanoparticelle d’oro (Np) utilizzando come linker il marcatore Raman
para-amminotiofenolo (4-ATP), già impiegato con successo nella realizzazione di “substrati SERS”. Abbiamo quindi realizzato un substrato di cattura, utilizzando Azzurrina
come proteina partner, sul quale abbiamo incubato il sistema p53-(4-ATP-Np) in
condizioni fisiologiche. Seguendo le bande SERS caratteristiche del sistema p53-(4-ATPNp),
legato all’Azzurina, abbiamo rilevato p53 inizialmente presente a concentrazioni
subpicomolari, mettendo in evidenza che la metodologia utilizzata è ultrasensibile, rapida e
di ampio respiro in ambito diagnostico.
Utilizzando la tecnologia SPR abbiamo studiato l’interazione Az-p53, rilevando i
corrispondenti parametri cinetici e di affinità. Inoltre, allo scopo di fornire nuove
informazioni riguardo al meccanismo di stabilizzazione di p53 in cellule tumorali, abbiamo
valutato l’effetto della presenza di Azzurrina sull’interazione funzionale Mdm2-p53,
utilizzando strutture proteiche intere nel loro corretto folding nativo. A tale scopo, abbiamo
estratto le costanti di velocità di reazione dei complessi Mdm2-p53 e Az-p53, e li abbiamo
comparati con quelle ottenute dall'interazione tra Azzurrina ed il preformato complesso
Mdm2-p53, e tra Mdm2 ed il preformato complesso Az-p53. L’analisi ha rivelato che
Azzurrina può legare p53 in maniera specifica e stabile senza subire variazioni cinetiche e
di affinità significative anche in presenza di Mdm2, suggerendo quindi che Azzurrina ed
Mdm2 non interagiscono con la stessa regione di p53. Questo risultato è stato confermato
anche mediante studi competitivi eseguiti a livello di singola molecola utilizzando la
Spettroscopia a Forza Atomica (AFS). Nonostante il sito di legame per p53 non sia lo
stesso, quando Azzurrina lega p53 l'interazione tra Mdm2 e p53 viene significativamente
influenzata poiché la costante di velocità di associazione tra le due proteine viene ridotta di
più di 4 volte. Questo significa che Azzurrina può esercitare un’azione d’inibizione
parziale del legame Mdm2-p53 attraverso un meccanismo a distanza che implica la
formazione di un legame Az-p53 che può essere localizzato o sul dominio N-terminale di
p53 ma in posizione distinta da quella preposta per l’interazione con Mdm2, oppure sul suo
“DNA-binding domain” (DBD), come predetto da recenti lavori computazionali.
Inoltre sono state eseguite misure di dicroismo circolare allo scopo di verificare eventuali
modificazioni strutturali indotte da Azzurrina sulla struttura di p53. Quest’indagine ha
infatti evidenziato che p53 in presenza di Az è soggetta ad un aumento del 10% del folding
secondario nativo. Ciò fa pensare che il meccanismo d’inibizione possa essere di tipo
allosterico e suggerisce interessanti prospettive per la progettazione di farmaci in grado di
riattivare le funzioni di repressore tumorale di p53, ad esempio nei tumori che
sovraesprimendo Mdm2 mantengono inibita l’attività di p53. Alla luce dei risultati ottenuti in questo lavoro, che hanno una rilevanza sia in campo
diagnostico che terapeutico, crediamo che l’approccio nanoscientifico per la ricerca di
analiti a bassissime concentrazioni possa realmente costituire uno strumento a tutela della
salute umana.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2417
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