Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2413
Title: Biotechnological production of vanillin from natural feedstocks
Other Titles: Produzione biotecnologica di vanillina da materie prime naturali
Authors: Di Matteo, Paola
Keywords: Vanillin;PV acylase;E. Coli;Streptomyces mobaraensis;Recovery adsorption;Vanillina;PV acilasi;Recupero adsorbimento;CHIM/11
Issue Date: 17-Feb-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
This PhD research project was focused on innovative biotechnological production and recovery of vanillin and vanillin precursors. Nowadays, flavours cover over a quarter of the world market for food additives. Flavouring compounds are mainly produced via chemical synthesis or by extraction from natural materials. Flavours obtained by chemical synthesis of starting natural substances cannot legally be labelled as natural and the environmentally unfriendly production processes are subject to various problems such as lacks substrate selectivity, which may cause the formation of unwanted compounds thus reducing process efficiency and increasing downstream costs. On the other hand, the extraction processes from plants is often expensive because of the low concentrations of the molecule of interest in the raw material. Moreover the cost depends on uncontrollable factors such as plant diseases and weather conditions. The drawbacks of both methods and the increasing interest of consumers in natural product, reported in recent market survays, have led to the search for other strategies to produce natural flavours. Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) is the most widely used flavoring in food and pharmaceutical industries. Chemically synthesized vanillin accounts nowadays for more than 99 % of the total market share. Extraction from vanilla beans is expensive and limited by plant supply, curing time and labour cost. Those factors make vanillin a promising target for biotechnological flavour production. As the Regulation (EC) no 1334/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 specify, vanillin produced in biotechnological processes starting from natural substrates can be classified as natural flavouring on condition that the natural starting material is specified. In recent years a large number of studies have been made on natural vanillin biosynthesis using microorganisms or isolated enzymes. However, these bioconversions are not yet economically feasible.
The high chemical activity and toxicity of vanillin cause low yield from ferulic acid. Moreover little vanillin was accumulated due to the higher degrading rate of this molecule than that of ferulic acid.
Biovanillin can be synthesized using cells or enzymes starting from different natural compounds, such as ferulic acid, eugenol or capsaicin. The latter, ((6E)-N-(4-hydroxi-3-metoxibenzil)-8-metil-6-nonenamide) is the pungent compound in chili pepper related plants of the Capsicum family. It can be hydrolyzed to vanillylamine, (4-hydroxy-3-methoxybenzylamine), a natural precursor of vanillin, by cleavage of its amine bond using specific microbial acylases. The aims of the thesis were: to enhance vanillin production
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from resting cells of E. coli engineering strains, starting from ferulic acid and by using XAD-4® resin and a new two/phase system of agarose gels and ferulic acid for the controlled release of the substrate in the bioconversion medium (1), to evaluate different strategies for enhancing the production of the capsaicin acylase from Streptomyces mobaraensis DSM40847 strain (2), to identify optimal conditions for capsaicin hydrolysis by using the acylase from Streptomyces mobaraensis DSM40847 strain (3), to develop efficient procedures for the recovery of vanillin from diluted aqueous solutions (4).
Experiments carried out using whole cells or crude enzyme preparations demonstrated that: (a) the two phase system of agarose gel and ferulic acid developed in this work was compatible with the bioconversion and it permitted to reduce the toxic effect of the ferulic acid; (b) selective recovery of the product, using macroporous resins in an off-line process, enhances the biological conversion of ferulic acid to vanillin using resting cells of Escherichia coli engineering strains; (c) thermal pre-treatment at 55°C of crude PVA acylase from Streptomyces mobaraensis DSM40847 improves the conversion of capsaicin to vanillylamine; (d) liquid/liquid extraction with n-butyl acetate allowed high recovery and high selectivity and supplied the best result in the recovery of vanillin from aqueous solutions.

Questo progetto di tesi ha riguardato lo studio e l’ottimizzazione di un processo biotecnologico innovativo per la produzione di vanillina e di suoi precursori naturali. La ricerca include lo sviluppo di un’efficiente procedura di recupero della vanillina prodotta.
Oggi, il mercato degli aromi ricopre circa un quarto di quello mondiale degli additivi alimentari. I composti aromatici vengono generalmente prodotti per via chimica e sintetica o per via estrattiva da matrici naturali. Gli aromi ottenuti per via sintetica da materia prima naturale non sono classificabili come “naturali” e i processi produttivi dannosi per l’ambiente, sono soggetti a molti problemi come la perdita di selettività di substrato, che può causare la formazione di composti non voluti, con riduzione nell’efficienza di processo e aumenti nei costi di recupero. D’altra parte i processi di estrazione dalle piante sono spesso costosi a causa delle basse concentrazioni delle molecole di interesse nelle matrici naturali. Inoltre i costi dipendono da fattori non controllabili come le condizioni climatiche e le malattie. Gli svantaggi di entrambe i metodi descritti e il crescente interesse dei consumatori per i prodotti naturali, riportato in recenti indagini di mercato, ha portato alla ricerca di nuove strategie per la produzione di aromi naturali.
La vanillina è il composto carattere dell’aroma di vaniglia che viene largamente utilizzato in campo farmaceutico ed alimentare. La vanillina ottenuta per via sintetica ricopre circa il 99% del mercato mondiale. L’estrazione dai baccelli curati della vaniglia è molto costosa e limitata dalle produzione delle piantagioni, dai tempi del processo di cura e dai costi della manodopera. Questi fattori rendono la vanillina un target commerciale importante per le industrie biotecnologiche. In accordo con la direttiva europea (EC) numero 1334/2008 del parlamento e del consiglio europeo del 16 dicembre 2008, la vanillina prodotta per via biotecnologica a partire da materie prime naturali è classificabile come aroma naturale a condizione che la matrice di partenza venga sempre specificata. Negli anni passati sono stati condotti molti studi sulla produzione biotecnologica di vanillina per via microbica ed enzimatica a partire da materie prime naturali. Questi processi di bioconversione non sono ancora competitivi dal punto di vita economico. Infatti, l’elevata attività chimica e la tossicità della vanillina determinano base rese nel processo di bioconversione.
La biovanillina può essere sintetizzata utilizzando cellule microbiche o enzimi a partire da diverse matrici naturali come l’acido ferulico, l’eugenolo e la capsaicina. Quest’ultima, ((6E)-N-(4-hydroxi-3-metoxibenzil)-8-metil-6-nonenamide), è il composto che conferisce la nota pungente al peperoncino della specie Capsicum.
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La capsaicina può essere idrolizzata da un’acilasi di origine microbica che rompe il legame amminico e determina la formazione di vanillil ammina (4-hydroxy-3-methoxybenzylamine) un precursore naturale della vanillina.
Gli obiettivi della tesi di dottorato sono stati i seguenti:
ottimizzare la produzione di vanillina a partire da acido ferulico utilizzando cellule resting di ceppi ingegnerizzati di E.coli, effettuando un recupero in situ del prodotto con la resina XAD-4® e impiegando un nuovo sistema bifasico di gel di agarosio e acido ferulico per il rilascio controllato del substrato nel mezzo di bioconversione (1); ottimizzare la produzione di acilasi attiva su capsaicina dal ceppo DSM40847 di Streptomyces mobaraensis (2), stabilire le condizioni ottimali per la reazione di idrolisi della capsaicina utilizzando l’acilasi prodotta dal ceppo DSM40847 di Streptomyces mobaraensis (3), sviluppare efficienti metodi di recupero della vanillina da soluzioni acquose (4).
Gli esperimenti condotti utilizzando cellule microbiche o preparati enzimatici grezzi hanno dimostrato che: (a) il sistema bi-fasico di agarosio ed acido ferulico sviluppato in questo studio, è compatibile con la bioconversione e permette di ridurre l’effetto tossico dell’acido ferulico sulle cellule resting di ceppi ingegnerizzati di E.coli; (b) l’impiego di una resina macroporosa in un processo off-line di recupero del prodotto permette di aumentare la conversione biologica di acido ferulico usando cellule resting di ceppi ingegnerizzati di E.coli; (c) un pre-trattamento termico a 55°C del preparato enzimatico grezzo di acilasi attiva su capsaicina ottenuto dal ceppo DSM40847 di Streptomyces mobaraensis aumenta la resa di conversione della capsaicina in vanillil ammina; (d) l’utilizzo della tecnica di estrazione con n-butil acetato ha fornito alte percentuali di recupero in vanillina e alta selettività tra acido ferulico e vanillina in soluzione acquose dei due composti.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologia degli alimenti
URI: http://hdl.handle.net/2067/2413
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