Il metabolismo delle ossilipine: caratteristiche biochimiche, localizzazione endocellulare ed attivazione in leguminose in risposta a stress abiotici

Abstract

Le leguminose sono un importante fonte proteica vegetale e rappresentano circa il 25% delle produzioni agricole mondiali. Essendo ricche di amido e sali minerali, rivestono un ruolo fondamentale nell’alimentazione umana ed in quella degli animali da allevamento; inoltre la loro capacità di instaurare rapporti di simbiosi a livello radicale con organismi azoto fissatori, le rende autosufficienti dal punto di vista degli input chimici. Tuttavia, come altre colture di interesse agronomico, risultano essere sensibili a stress di varia natura (biotici ed abiotici) che ne limitano la produttività. Tra gli stress abiotici, la carenza idrica e l’eccessiva salinità del terreno risultano essere tra le più importanti cause di perdita di produzione agricola, sia nelle regioni Mediterranee che a livello mondiale. Le basi fisiologiche di siccità e salinità si sovrappongono, essendo entrambe causa di stress osmotico. La capacità delle piante di sopravvivere in condizioni ambientali avverse dipende dalla loro abilità di adattarsi ai cambiamenti dell’ambiente circostante. Per far ciò, hanno sviluppato una serie di meccanismi regolatori che implicano l’attivazione di particolari molecole segnale, mediatrici della risposta adattativa richiesta. La crescita e lo sviluppo della pianta sono strettamente dipendenti dal sistema radicale della pianta stessa e dal suo ruolo nel rifornimento di acqua e sali minerali. Gli stress abiotici legati al suolo, come appunto la siccità o la salinità del terreno, influiscono in maniera rilevante sulla crescita e l’architettura della pianta, essendo la radice l’organo che maggiormente risente di tali condizioni ambientali. Anche a tale livello, il recupero di funzionalità di questo tessuto avviene per opera di alcuni geni che adattano lo sviluppo radicale a condizioni ambientali avverse. Dati sperimentali, ottenuti analizzando l’espressione genica di leguminose modello che presentano un recupero nella crescita radicale dopo essere state sottoposte a stress salino, evidenziano un potenziale coinvolgimento, oltre che di geni regolatori, anche di alcuni geni coinvolti nel metabolismo di una particolare classe di composti: le ossilipine. Inoltre, analisi SuperSAGE, atte a caratterizzare l’espressione genica in risposta a stress idrico e salino in leguminose di interesse agronomico quali il cece (C. arietinum), hanno evidenziato una sovraespressione di geni codificanti per alcuni enzimi implicati in tale metabolismo, in piante che presentano una maggiore tolleranza a tali tipi di stress. Per analizzare più in dettaglio il ruolo fisiologico della via biosintetica delle ossilipine nella risposta a stress abiotici, quali appunto la siccità e l’eccessiva salinità del suolo, sono stati dapprima allestiti esperimenti di silencing genico in radici di leguminose modello (Medicago truncatula) sottoposte a stress salino e poi analisi di espressione genica e quantificazione chimica dei prodotti di tale metabolismo su piante di cece, sottoposte a stress idrico. Gli esperimenti di silenziamento dei geni lox (lipossigenasi), hpl (idroperossidi liasi), aos (allene ossido sintasi) e aoc (allene ossido ciclasi) in radici di M. truncatula (genotipo Jemalong A17) hanno permesso di ottenere piantine composite sulle quali è stato valutato l’accrescimento radicale, in presenza ed in assenza di stress salino. Risultati, statisticamente significativi, sono stati ottenuti su radici aos-RNAi e aoc-RNAi sottoposte a stress, che presentano un allungamento radicale maggiore, paragonabile al rispettivo controllo cresciuto in assenza di sale. In queste radici inoltre, analisi preliminari hanno confermato un minore accumulo di OPDA, il precursore dell’acido jasmonico (JA), prodotto dalla azione a cascata degli enzimi AOS e AOC. Tale condizione potrebbe far supporre un minore accumulo di acido jasmonico e così un inibizione del cosiddetto “effetto bonsai” dovuto all’azione del JA. Parallelamente, le analisi di espressione genica condotta su piante di cece indicano chiaramente il coinvolgimento di tale via metabolica nelle prima fase della risposta allo stress idrico. Dal confronto di due varietà differentemente adattate alla siccità, ICC 1882 (sensibile) e ICC 4958 (tollerante), è emerso che nel genotipo tollerante sottoposto a stress viene sovra-regolato sia il ramo della via metabolica relativo ad HPL (implicata nella biosintesi di aldeidi volatili) che quello relativo a AOS (strettamente correlata alla sintesi di acido jasmonico). Tali risultati sono stati confermati dall’analisi quantitativa delle principali ossilipine accumulate a livello radicale durante lo stress idrico. In particolare, si è evidenziata una forte induzione di acido jasmonico e jasmonoil-isoleucina (JA-Ile) nella varietà tollerante, nelle prime ore di stress. Per quanto concerne la produzione di aldeidi volatili, i dati indicano una tardiva biosintesi di aldeidi a sei atomi di carbonio solo a tempi più lunghi dall’induzione dello stress in entrambe le varietà, con livelli più alti registrati nel genotipo sensibile. Questi risultati potrebbero indicare un scarsa disponibilità dei substrati per le isoforme di HPL espresse nei tessuti radicali nelle fasi precoci di induzione dello stress. I risultati relativi alla rapida induzione di acido jasmonico nella risposta della radice allo stress sono stati avvalorati da un lavoro di analisi chimica condotto su piantine di M. truncatula sottoposte a stress salino. Anche in questa leguminosa modello, sottoposta ad uno stress osmotico, si evidenzia un rapido accumulo a livello radicale di JA e JA-Ile, già ad un ora dall’inizio dello stress. Infine, lo studio della localizzazione dei principali enzimi coinvolti nella via metabolica risulta particolarmente importante per verificare la disponibilità dei substrati per l’attività catalitica dei vari enzimi operanti nel pathway metabolico delle ossilipine. Il frazionamento sub-cellulare di foglie di M. truncatula e la successiva analisi western ha permesso di determinare una localizzazione tilacoidale per MtAOS e MtAOC e stromale per MtLOX. Un pattern di localizzazione inaspettato è stato invece osservato per l’idroperossido liasi che non sembra avere una localizzazione plastidiale, nonostante la presenza di un putativo peptide di transito per il cloroplasto. Analisi di microscopia confocale utilizzando costrutti chimerici derivati dalla fusione di HPL, del solo peptide di transito e della restante parte della proteina con un tag fluorescente (GFP) hanno permesso di ipotizzare la presenza di altri segnali all’interno della proteina responsabili del sorting della proteina ai plastidi. La proteina quindi potrebbe legarsi dall’esterno al cloroplasto ed entrarvi a seguito di induzione del segnale di stress. Complessivamente, i risultati dell’attività svolta durante il dottorato di ricerca, indicano un importante ruolo della famiglia delle fito-ossilipine, ed in particolare degli jasmonati, nelle fasi precoci della risposta delle leguminose agli stress abiotici.

Legumes are important crop in sustainable agriculture because they can provide high value protein, support meat and dairy production and are unique in their ability to improve soil fertility through their symbiosis with nitrogen-fixing bacteria. However, legumes are sensitive to a number of abiotic stresses such as water deficit and soil salinity, which are a main cause of crop loss worldwide. Plants have evolved complex cell signalling pathways activating metabolic functions and developmental switches to cope with environmental stresses. Dissection of molecular mechanisms controlling plant response to environmental stresses is crucial to provide legume crops with improved stress tolerance. In a previous work, microarray analysis showed that among hormone and secondary metabolism category, four key-genes involved in the oxylipins metabolism were up-expressed in salt tolerant genotype, M. truncatula Jemalong A17, under salt stress condition. They are lipoxygenase (lox), hydroperoxide-lyase (hpl), allene oxide synthase (aos) and allene oxide cyclase (aoc). Furthermore, in another study, SuperSAGE technique was applied to the analysis of gene expression in chickpea roots in response to drought and salt stress. In both abiotic conditions, two genes, i.e a lipoxygenase and allene oxide synthase, involved in oxylipins pathway were upregulated. In this context, an important agronomic grain legume, chickpea (Cicer arietinum), and the model legume species M. truncatula (Jemalong A17) were subjected to drought and salt stress respectively to understand the possible involvement of this class of heterogeneous compounds in the response of legumes to abiotic stresses. At first, gene silencing experiments were carried out on Medicago plants. A RNA interference (RNAi) approach adopted to down-regulate the expression of lox, hpl, aos and aoc genes, yielded transgenic roots whose growth was valuated in presence and in absence of salt. Our results showed that aoc-RNAi and aos-RNAi roots were less sensitive to the presence of salt in the medium. Preliminary chemical analysis indicated a reduction in OPDA content in these roots; the possible absence of oxylipins (JA and JA-Ile) produced from OPDA could indicate an important role of jasmonats in the “bonsai effect”, a typical plant response to abiotic stresses. As far as the chickpea is concerned, we took advance of the SuperSAGE information available for this species to design new Taqman probes to study the expression of key genes involved in oxylipins metabolism. Therefore, qPCR was carried out on root samples from a drought-tolerant and a drought-sensitive chickpea variety. Our results indicated a sustained and earlier activation of a specific lipoxygenase (lox1) gene, two hydroperoxide lyases (hpl1 and hpl2), an allene oxide synthase (aos) and an oxo-phytodienoate reductase (opr) genes in the drought tolerant variety. These data were confirmed by the quantification of the main oxylipins derived from the AOS branch of the pathway. Higher levels of jasmonic acid (JA), its precursor 12-oxophytodienoic acid (OPDA) and the active form JA-isoleucine (JA-Ile) were detected in the root tissues of the tolerant variety, suggesting a role of jasmonates in the early signalling and in the tolerance mechanism in response to drought stress. This data was supported by HPLC analysis on M. truncatula plants subjected to salinity for different stress point. In these plants we founded high levels of JA and JA-Ile already at 1 hour from stress onset. HPLC quantification of other oxylipins on Cicer arietinum roots, i.e. the aldheydes produced by the HPL branch, indicated a hexanal accumulation only later during drought stress, thus suggesting a competition for the same substrate between AOS and HPL enzymes at earlier stress time points. In this context, we carried out a biochemical characterisation of the main enzymes of the oxylipin pathway detected in M. truncatula leaves. Western blot analysis suggested a thylacoid localisation for MtAOS and MtAOC, and a stromal for MtLOX. An unexpected distribution was founded for MtHPL: this protein, despite a plastidiali transit peptide (TP59) in N-terminal region, was not detected in the chloroplast fraction. These results were confirmed by confocal microscopy analyses obtained expressing some chimeric fluorescent proteins related to the M. truncatula HPL cDNA. Token together results from this research indicated an important role of jasmonates in the early signalling of abiotic stresses.