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Title: Il metabolismo delle ossilipine: caratteristiche biochimiche, localizzazione endocellulare ed attivazione in leguminose in risposta a stress abiotici
Other Titles: Oxylipins metabolism: biochemical features, endocellular localization and activation mechanism in legumes response to abiotic stresses
Authors: De Domenico, Stefania
Keywords: Ossilipine;Leguminose;Stress;Oxylipins;Legumes;BIO/13
Issue Date: 11-Apr-2012
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 24. ciclo;
Abstract: 
Le leguminose sono un importante fonte proteica vegetale e rappresentano circa il 25% delle
produzioni agricole mondiali. Essendo ricche di amido e sali minerali, rivestono un ruolo
fondamentale nell’alimentazione umana ed in quella degli animali da allevamento; inoltre la loro
capacità di instaurare rapporti di simbiosi a livello radicale con organismi azoto fissatori, le
rende autosufficienti dal punto di vista degli input chimici. Tuttavia, come altre colture di
interesse agronomico, risultano essere sensibili a stress di varia natura (biotici ed abiotici) che ne
limitano la produttività. Tra gli stress abiotici, la carenza idrica e l’eccessiva salinità del terreno
risultano essere tra le più importanti cause di perdita di produzione agricola, sia nelle regioni
Mediterranee che a livello mondiale. Le basi fisiologiche di siccità e salinità si sovrappongono,
essendo entrambe causa di stress osmotico. La capacità delle piante di sopravvivere in condizioni
ambientali avverse dipende dalla loro abilità di adattarsi ai cambiamenti dell’ambiente
circostante. Per far ciò, hanno sviluppato una serie di meccanismi regolatori che implicano
l’attivazione di particolari molecole segnale, mediatrici della risposta adattativa richiesta.
La crescita e lo sviluppo della pianta sono strettamente dipendenti dal sistema radicale della
pianta stessa e dal suo ruolo nel rifornimento di acqua e sali minerali. Gli stress abiotici legati al
suolo, come appunto la siccità o la salinità del terreno, influiscono in maniera rilevante sulla
crescita e l’architettura della pianta, essendo la radice l’organo che maggiormente risente di tali
condizioni ambientali. Anche a tale livello, il recupero di funzionalità di questo tessuto avviene
per opera di alcuni geni che adattano lo sviluppo radicale a condizioni ambientali avverse.
Dati sperimentali, ottenuti analizzando l’espressione genica di leguminose modello che
presentano un recupero nella crescita radicale dopo essere state sottoposte a stress salino,
evidenziano un potenziale coinvolgimento, oltre che di geni regolatori, anche di alcuni geni
coinvolti nel metabolismo di una particolare classe di composti: le ossilipine. Inoltre, analisi
SuperSAGE, atte a caratterizzare l’espressione genica in risposta a stress idrico e salino in
leguminose di interesse agronomico quali il cece (C. arietinum), hanno evidenziato una sovraespressione
di geni codificanti per alcuni enzimi implicati in tale metabolismo, in piante che
presentano una maggiore tolleranza a tali tipi di stress.
Per analizzare più in dettaglio il ruolo fisiologico della via biosintetica delle ossilipine nella
risposta a stress abiotici, quali appunto la siccità e l’eccessiva salinità del suolo, sono stati
dapprima allestiti esperimenti di silencing genico in radici di leguminose modello (Medicago
truncatula) sottoposte a stress salino e poi analisi di espressione genica e quantificazione chimica
dei prodotti di tale metabolismo su piante di cece, sottoposte a stress idrico.
Gli esperimenti di silenziamento dei geni lox (lipossigenasi), hpl (idroperossidi liasi), aos (allene
ossido sintasi) e aoc (allene ossido ciclasi) in radici di M. truncatula (genotipo Jemalong A17)
hanno permesso di ottenere piantine composite sulle quali è stato valutato l’accrescimento
radicale, in presenza ed in assenza di stress salino. Risultati, statisticamente significativi, sono
stati ottenuti su radici aos-RNAi e aoc-RNAi sottoposte a stress, che presentano un
allungamento radicale maggiore, paragonabile al rispettivo controllo cresciuto in assenza di sale.
In queste radici inoltre, analisi preliminari hanno confermato un minore accumulo di OPDA, il
precursore dell’acido jasmonico (JA), prodotto dalla azione a cascata degli enzimi AOS e AOC.
Tale condizione potrebbe far supporre un minore accumulo di acido jasmonico e così un
inibizione del cosiddetto “effetto bonsai” dovuto all’azione del JA.
Parallelamente, le analisi di espressione genica condotta su piante di cece indicano chiaramente
il coinvolgimento di tale via metabolica nelle prima fase della risposta allo stress idrico. Dal
confronto di due varietà differentemente adattate alla siccità, ICC 1882 (sensibile) e ICC 4958
(tollerante), è emerso che nel genotipo tollerante sottoposto a stress viene sovra-regolato sia il
ramo della via metabolica relativo ad HPL (implicata nella biosintesi di aldeidi volatili) che
quello relativo a AOS (strettamente correlata alla sintesi di acido jasmonico). Tali risultati sono
stati confermati dall’analisi quantitativa delle principali ossilipine accumulate a livello radicale
durante lo stress idrico. In particolare, si è evidenziata una forte induzione di acido jasmonico e
jasmonoil-isoleucina (JA-Ile) nella varietà tollerante, nelle prime ore di stress. Per quanto
concerne la produzione di aldeidi volatili, i dati indicano una tardiva biosintesi di aldeidi a sei
atomi di carbonio solo a tempi più lunghi dall’induzione dello stress in entrambe le varietà, con
livelli più alti registrati nel genotipo sensibile. Questi risultati potrebbero indicare un scarsa
disponibilità dei substrati per le isoforme di HPL espresse nei tessuti radicali nelle fasi precoci di
induzione dello stress.
I risultati relativi alla rapida induzione di acido jasmonico nella risposta della radice allo stress
sono stati avvalorati da un lavoro di analisi chimica condotto su piantine di M. truncatula
sottoposte a stress salino. Anche in questa leguminosa modello, sottoposta ad uno stress
osmotico, si evidenzia un rapido accumulo a livello radicale di JA e JA-Ile, già ad un ora
dall’inizio dello stress.
Infine, lo studio della localizzazione dei principali enzimi coinvolti nella via metabolica risulta
particolarmente importante per verificare la disponibilità dei substrati per l’attività catalitica dei
vari enzimi operanti nel pathway metabolico delle ossilipine.
Il frazionamento sub-cellulare di foglie di M. truncatula e la successiva analisi western ha
permesso di determinare una localizzazione tilacoidale per MtAOS e MtAOC e stromale per
MtLOX. Un pattern di localizzazione inaspettato è stato invece osservato per l’idroperossido
liasi che non sembra avere una localizzazione plastidiale, nonostante la presenza di un putativo
peptide di transito per il cloroplasto. Analisi di microscopia confocale utilizzando costrutti
chimerici derivati dalla fusione di HPL, del solo peptide di transito e della restante parte della
proteina con un tag fluorescente (GFP) hanno permesso di ipotizzare la presenza di altri segnali
all’interno della proteina responsabili del sorting della proteina ai plastidi. La proteina quindi
potrebbe legarsi dall’esterno al cloroplasto ed entrarvi a seguito di induzione del segnale di
stress.
Complessivamente, i risultati dell’attività svolta durante il dottorato di ricerca, indicano un
importante ruolo della famiglia delle fito-ossilipine, ed in particolare degli jasmonati, nelle fasi
precoci della risposta delle leguminose agli stress abiotici.

Legumes are important crop in sustainable agriculture because they can provide high value
protein, support meat and dairy production and are unique in their ability to improve soil fertility
through their symbiosis with nitrogen-fixing bacteria. However, legumes are sensitive to a
number of abiotic stresses such as water deficit and soil salinity, which are a main cause of crop
loss worldwide.
Plants have evolved complex cell signalling pathways activating metabolic functions and
developmental switches to cope with environmental stresses. Dissection of molecular
mechanisms controlling plant response to environmental stresses is crucial to provide legume
crops with improved stress tolerance.
In a previous work, microarray analysis showed that among hormone and secondary metabolism
category, four key-genes involved in the oxylipins metabolism were up-expressed in salt tolerant
genotype, M. truncatula Jemalong A17, under salt stress condition. They are lipoxygenase (lox),
hydroperoxide-lyase (hpl), allene oxide synthase (aos) and allene oxide cyclase (aoc).
Furthermore, in another study, SuperSAGE technique was applied to the analysis of gene
expression in chickpea roots in response to drought and salt stress. In both abiotic conditions,
two genes, i.e a lipoxygenase and allene oxide synthase, involved in oxylipins pathway were upregulated.
In this context, an important agronomic grain legume, chickpea (Cicer arietinum), and the model
legume species M. truncatula (Jemalong A17) were subjected to drought and salt stress
respectively to understand the possible involvement of this class of heterogeneous compounds in
the response of legumes to abiotic stresses.
At first, gene silencing experiments were carried out on Medicago plants. A RNA interference
(RNAi) approach adopted to down-regulate the expression of lox, hpl, aos and aoc genes,
yielded transgenic roots whose growth was valuated in presence and in absence of salt. Our
results showed that aoc-RNAi and aos-RNAi roots were less sensitive to the presence of salt in
the medium. Preliminary chemical analysis indicated a reduction in OPDA content in these
roots; the possible absence of oxylipins (JA and JA-Ile) produced from OPDA could indicate an
important role of jasmonats in the “bonsai effect”, a typical plant response to abiotic stresses.
As far as the chickpea is concerned, we took advance of the SuperSAGE information available
for this species to design new Taqman probes to study the expression of key genes involved in
oxylipins metabolism. Therefore, qPCR was carried out on root samples from a drought-tolerant
and a drought-sensitive chickpea variety. Our results indicated a sustained and earlier activation
of a specific lipoxygenase (lox1) gene, two hydroperoxide lyases (hpl1 and hpl2), an allene oxide
synthase (aos) and an oxo-phytodienoate reductase (opr) genes in the drought tolerant variety.
These data were confirmed by the quantification of the main oxylipins derived from the AOS
branch of the pathway. Higher levels of jasmonic acid (JA), its precursor 12-oxophytodienoic
acid (OPDA) and the active form JA-isoleucine (JA-Ile) were detected in the root tissues of the
tolerant variety, suggesting a role of jasmonates in the early signalling and in the tolerance
mechanism in response to drought stress.
This data was supported by HPLC analysis on M. truncatula plants subjected to salinity for
different stress point. In these plants we founded high levels of JA and JA-Ile already at 1 hour
from stress onset.
HPLC quantification of other oxylipins on Cicer arietinum roots, i.e. the aldheydes produced by
the HPL branch, indicated a hexanal accumulation only later during drought stress, thus
suggesting a competition for the same substrate between AOS and HPL enzymes at earlier stress
time points.
In this context, we carried out a biochemical characterisation of the main enzymes of the
oxylipin pathway detected in M. truncatula leaves. Western blot analysis suggested a thylacoid
localisation for MtAOS and MtAOC, and a stromal for MtLOX. An unexpected distribution was
founded for MtHPL: this protein, despite a plastidiali transit peptide (TP59) in N-terminal region,
was not detected in the chloroplast fraction. These results were confirmed by confocal
microscopy analyses obtained expressing some chimeric fluorescent proteins related to the M.
truncatula HPL cDNA.
Token together results from this research indicated an important role of jasmonates in the early
signalling of abiotic stresses.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2412
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