Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2411
Title: Studio del ruolo della ciclina D3 nella proliferazione e nel differenziamento delle cellule progenitrici del muscolo scheletrico
Other Titles: Study of the role of cyclin D3 in muscle progenitor cells during proliferation and differentiation
Authors: De Luca, Giulia
Keywords: Miogenesi;Cellule satelliti;Ciclina D3;Myogenesis;Satellite cells;Cyclin D3;BIO/11
Issue Date: 12-Apr-2012
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 24. ciclo
Abstract: 
Il requisito necessario per il differenziamento dei precursori muscolari è che questi abbandonino definitivamente il ciclo cellulare. La progressione e l’arresto del ciclo cellulare sono sotto il controllo di regolatori positivi, quali le chinasi ciclina-dipendenti (CDK) e le loro subunità regolative (le cicline), e di regolatori negativi quali gli inibitori delle CDK e i prodotti dei geni appartenenti alla famiglia retinoblastoma (Rb). In questo contesto la ciclina D3, la cui espressione è indotta dal capostipite dei fattori regolatori miogenici MyoD durante la transizione tra fase proliferativa e differenziamento, rappresenta un’eccezione. La ciclina D3, inoltre, è l’unica ciclina ad accumularsi nei miociti post-mitotici formando complessi con CDK4 e la forma non fosforilata di pRb.
Nel muscolo scheletrico di topo i livelli di espressione della ciclina D3 sono elevati nei primi 14 giorni di vita post-nascita per poi diminuire rapidamente e mantenenersi molto bassi nel corso della vita adulta, così come accade a vari geni regolatori della proliferazione e del differenziamento espressi nelle cellule satelliti attivate che sono responsabili della crescita del muscolo post-nascita. A seguito di danno muscolare l’espressione della ciclina D3 viene nuovamente indotta nel muscolo adulto, insieme a quella dei marcatori delle cellule satelliti attivate, suggerendo un ruolo fisiologico della ciclina D3 nella miogenesi rigenerativa.
Il silenziamento della ciclina D3 nei mioblasti C2 è caratterizzato da un sostanziale anticipo dell’espressione dei geni muscolo-specifici (miogenina, catena pesante della miosina e α-actina, per esempio) rispetto alle cellule C2 di controllo. Inoltre, i mioblasti in cui la ciclina D3 è interferita tendono ad arrestare precocemente la proliferazione, fondendosi a formare miotubi che risultano essere più piccoli e in numero minore rispetto a quanto riscontrato nei mioblasti di controllo. Il silenziamento della ciclina D3 determina infatti una significativa diminuzione della percentuale di mioblasti in fase S e un significativo aumento di quella di mioblasti in fase G1 rispetto i mioblasti non interferiti.
Analisi immunoistochimiche condotte sul muscolo scheletrico adulto del topo knock-out per la ciclina D3 hanno messo in evidenza un ridotto numero di cellule satelliti quiescenti associate alle miofibre rispetto ad animali wild-type.
La ciclina D3 influenza, inoltre, la progressione nel ciclo cellulare dei precursori miogenici attivati. Le colture di mioblasti primari ciclina D3-/- mostrano un evidente difetto nella proliferazione e sono caratterizzate da una percentuale significativamente minore di cellule in fase S e una maggiore percentuale di cellule in fase G2/M rispetto ai controlli wild-type. Tuttavia i mioblasti ciclina D3-/-, seppur soggetti a evidenti difetti proliferativi, sono capaci di differenziare in miotubi multinucleati.
I risultati descritti in questo lavoro di tesi testimoniano per la prima volta che la ciclina D3 svolge un ruolo funzionale non vicariabile dalle altre cicline di tipo D nel controllo del bilancio tra proliferazione e differenziamento delle cellule progenitrici muscolari.

The irreversible exit from the cell cycle is a necessary requisite for the differentiation of muscle cell precursors. Cell cycle progression and exit from the cell cycle are positively controlled by cell cycle activators, such as the cyclins and cyclin dependent kinases (CDK), and negatively controlled by cell cycle inhibitors, such as the CDK inhibitors and the retinoblastoma (Rb) family gene products. In this context, cyclin D3, whose expression is induced by the master myogenic regulatory factor MyoD during the transition from the proliferation to the differentiation stage, represents an exception. Moreover, cyclin D3 is the only cyclin that accumulates in post-mitotic myocytes by forming complexes with CDK4 and hypophosphorylated pRb.
Cyclin D3 protein is expressed at high levels in mouse skeletal muscle in vivo during the first 14 days after birth, but its expression declines to a low level in adult muscle. This expression pattern is similar to that of different proliferation and differentiation regulatory genes expressed in the activated satellite cells, which are involved in the post-natal muscle growth. Upon injury, cyclin D3 expression is induced in adult muscle, together with that of activated satellite cell markers, suggesting a physiological role for cyclin D3 in regenerative myogenesis.
Downregulation of cyclin D3 in C2 myoblasts by RNA interference induces a substantial anticipation of muscle gene expression (myogenin, myosin heavy chain and α-actin, for example) as compared to control C2 cells. Cyclin D3-depleted cells exit from the cell cycle precociously, fusing into multinucleated myotubes which are smaller in size and reduced in number respect to control myoblasts. Indeed, cyclin D3 downregulation leads to a significant decrease of the S-phase cells proportion concomitant to a significant increase of the G1-phase cell population compared with control cells.
Immunohistochemical analysis performed on cyclin D3 knock-out adult skeletal muscle shows a reduced number of myofiber-associated quiescent satellite cells, as compared to wild-type mice.
Moreover, cyclin D3 affects myogenic precursor cell proliferation. In fact, cyclin D3-/- primary myoblasts in culture show an evident proliferative defect and are characterized by a significant decrease of the S-phase cell proportion in concomitance with a significant increase of the G2/M-phase cell population compared with control wild-type cells. However, cyclin D3-/- myoblasts, although characterized by an evident proliferative deficit, are capable of myogenic differentiation.
The results shown in this thesis provide the first evidence that cyclin D3 plays a unique functional role, which is not vicariated by the others D type cyclins, in regulating the balance between proliferation and differentiation of skeletal muscle precursor cells.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/2411
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