Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/241
Title: Effetti immunologici di orzo, segale ed avena sulla mucosa intestinale di soggetti affetti da malattia celiaca: attivazione specifica in vitro
Other Titles: Immunological effect of rye, barley and oats in the intestinal mucosa of subjects suffering of celiac disease: in vitro specific attivation
Authors: Di Tola, Marco
Keywords: Malattia celiaca;Gliadina;Avenina;Ordeina;Secalina;Coltura di organo;Celiac Disease;Gliadin;Avenin;Ordein;Secalin;Organ culture;AGR/07
Issue Date: 30-Nov-2007
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 18. ciclo
Abstract: 
La malattia celiaca (MC) è un’enteropatia autoimmune causata da una risposta infiammatoria diretta contro il glutine che colpisce individui geneticamente predisposti. In ogni caso, dopo più di cinquant’anni dall’identificazione del glutine come antigene causale della MC, solo il frumento tenero è stato largamente studiato con i più opportuni metodi sperimentali. Altri cereali quali l’orzo e la segale, a causa della loro relazione tassonomica con il frumento, sono considerati tossici. D’altra parte la coltura d’organo, un metodo specifico e affidabile applicato sia al protocollo diagnostico che alle procedure sperimentali riguardanti la MC, è stato recentemente arruolato allo scopo di chiarire il ruolo di altri cereali nella MC. Nel presente studio, lo scopo è stato quello di valutare la presenza degli anticorpi anti-transglutaminasi tessutali (anti-tTG, risposta umorale) e dei segni di attivazione immunologica (risposta cellulo-mediata) su campioni bioptici ottenuti da pazienti celiaci trattati coltivati sia con che senza prolamine estratte da vari cereali.
I campioni bioptici intestinali, ottenuti a mezzo di endoscopia, sono stati posti su una griglia di acciaio, posizionata sopra il pozzetto centrale di una piastra per coltura d’organo, con la superficie villare disposta in alto e coltivati, in una miscela di O2 (95%) e CO2 (5%), per 24 ore at 37°C in presenza o in assenza del digesto peptico-triptico (PT) di gliadina, avenina, ordeina e secalina. Al termine della coltura, i campioni sono stati orientati, imbibiti in OCT e congelati in azoto liquido. Le sezioni criostatiche (4 mm) sono state testate con anticorpi monoclonali diretti contro il CD25 e l’ICAM-1. Il numero delle cellule esprimenti CD25 o ICAM-1 è stato valutato entro 1 mm2 di lamina propria tramite un microscopio a luce ottica equipaggiato con una griglia calibrata. Inoltre, i sovranatanti sono stati raccolti e conservati a -70°C, fino all’uso. Gli anticorpi anti-tTG sono stati misurati, in sovranatanti di coltura diluiti 1:5, tramite metodica ELISA.
L’analisi immunoistochimica ha rivelato che il numero medio delle cellule positive al CD25 e all’ICAM-1 per mm2 di LP dei campioni bioptici coltivati con PT-gliadina, -ordeina e -secalina sono significativamente più alti rispetto a quelli coltivati con PT-avenina o nel solo terreno. Le concentrazioni degli anti-tTG nei sovranatanti dei campioni bioptici coltivati con PT-gliadina, -ordeina, -secalina e -avenina è significativamente più alto rispetto a quelli coltivati in solo terreno.
I risultati del presente studio sono in grado di indicare che le prolamine dell’orzo e della segale sono tossici almeno quanto quelle del frumento. Inoltre, in relazione alle prolamine dell’avena, i dati suggeriscono una dissociazione tra le risposte umorali e cellulo-mediate. In altre parole, rispetto al frumento, all’orzo e alla segale, l’avena può interagire con la mucosa intestinale dei pazienti celiaci con una diversa, Th2-mediata, catena di eventi.

Celiac disease (CD) is an autoimmune enterophaty caused by an abnormal immune response to dietary gluten that occurs in genetically susceptible individuals. However, after more than fifty years from the identification of gluten as the culprit antigen of CD, only bread wheat has been widely studied with the opportune experimental methods. Other grains, such as rye and barley, are considered toxic because their taxonomic relationship to wheat. On the other hand, organ culture, a reliable and specific method applied either to the diagnostic protocol or to experimental procedures regarding CD, has recently been employed in order to clarify the role of other grains in CD. In this study, the overall aim was to evaluate the occurrence of anti-transglutaminase (anti-tTG) antibodies (umoral response) and of signs of the immunological activation (cell-mediated response) on biopsy samples obtained from treated CD cultured either with or without grains prolamins.
Intestinal biopsy samples, obtained by means of endoscopy, were placed on a stainless steel grid, positioned over the central well of an organ culture dish, with the villous surface uppermost and cultured, in a mixture of O2 (95%) and CO2 (5%), for 24 hours at 37°C in presence and in absence of the peptic-tryptic (PT)-digest of gliadin, avenin, ordein and secalin. After culture, specimens were oriented, embedded in OCT and snap frozen in liquid nitrogen. Cryostat sections (4 mm) were tested with monoclonal antibodies (MoAbs) directed against CD25 and ICAM-1. Number of cells expressing CD25 or ICAM-1 was evaluated within 1 mm2 of LP by a light microscope equipped with a calibrated ocular grid. Furthermore, supernatants were collected and stored at -70°C, until used. Anti-tTG antibodies were measured, in culture supernatants diluted 1:5, by an enzyme-immunoassay (ELISA) method.
Immunohistochemical assay revealed that the mean number of positive cells to CD25 and ICAM-1 per mm2 of LP in the biopsy samples cultured with PT-gliadin, -ordein and -secalin was significantly higher than in those cultured with PT-avenin or in medium alone. Anti-tTG concentrations in supernatants in the biopsy samples cultured with PT-gliadin, -ordein, -secalin and -avenin was significantly higher than in those cultured in medium alone.
The results of this study in able to indicate that rye and barley prolamins are toxic at least as the the wheat prolamins. Furthermore, in regard to the oats prolamins, data strongly suggest a dissociation between the umoral and the cell-mediated responses. In other words, with respect to wheat, rye and barley, oats could affect the intestinal mucosa of CD patients in a different, Th2-mediated, manner.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/241
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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