Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/2067/2409
Titolo: Analisi funzionale di un promotore Heat Shock di girasole e sue applicazioni biotecnologiche
Altri titoli: Functional analysis of a sunflower HS promoter and its biotechnological applications
Autori: De Pascali, Mariarosaria
Parole chiave: Espressione genica;Stress abiotici;Girasole;Promotori heat shock;Gene expression;Abiotic stress;Sunflower;Heat shock promoters;BIO/13
Data pubblicazione: 21-mar-2011
Editore: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Serie/Fascicolo n.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
Le piante rispondono agli stimoli ambientali, come lo stress da alte temperature (HS),
mediante una riprogrammazione delle attività cellulari, regolata principalmente a livello
trascrizionale, che prevede l’attivazione di geni che codificano per proteine specifiche
(HSP). Oggetto di questo lavoro è l’analisi della regione di DNA genomico compresa tra
due geni di girasole (HaHSP17.6a e HaHSP17.6b), che codificano per due HSP a basso
peso molecolare, associati fisicamente, con orientamento invertito e separati da una
regione intergenica di 3809 bp. Le regioni codificanti dei due geni presentano solo lievi
differenze, essi differiscono solo per 30 nucleotidi che nella sequenza aa dedotta danno una
sostituzione di solo 8 aa. Tuttavia, essi hanno un profilo di espressione molto differente ciò
dipende con molta probabilità dal fatto che sono regolati in maniera diversa a causa di
differenze nei loro promotori.
Il confronto della sequenza della regione intergenica con quelle presenti nelle banche dati
PLACE e PlantCARE, ha reso possibile definire la struttura di questa regione che contiene
le sequenze che regolano l’espressione dei due geni.
Mediante l’analisi in silico sono stati individuati gli elementi caratteristici dei promotori
HS vegetali (TATA box, HSE, CCAAT box) e altri elementi cis-agenti coinvolti nella
risposta ad altri tipi di stress. Tali elementi sono presenti in numero e in posizioni diverse
nelle regioni a monte dei due geni e ciò potrebbe spiegare la notevole diversità
nell’inducibilità dei due geni in risposta ai diversi stress. Per verificare il ruolo funzionale
delle sequenze identificate è stata quindi effettuata un’analisi funzionale mediante
delezioni progressive della regione a monte del gene più responsivo, HaHSP17.6b. Sono
stati prodotti costrutti contenenti il gene reporter GFP, posto sotto il controllo dei
frammenti di diversa lunghezza ottenuti dalla regione a monte di HaHSP17.6b. Questi
plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per effettuare saggi di espressione transiente in
protoplasti di Nicotiana tabacum sottoposti a stress diversi. I dati ottenuti indicano che
l’espressione del gene GFP è indotta non solo in risposta alle alte temperature, ma anche in
risposta allo stress da metalli pesanti, stress salino, da basse temperature e da acido
abscissico. L’incremento dell’espressione di GFP è massimo quando esso è posto sotto il
controllo di tutta la (1682 bp) a monte del gene HaHSP17.6b. Tuttavia il livello di
trascrizione non decresce significativamente quando vengono utilizzati i costrutti
contenenti porzioni parziali di questa regione.
E’ interessante notare che il livello di espressione che si ottiene con il promotore HS è
paragonabile a quello ottenuto utilizzando il promotore forte CaMV35S. Il promotore HS
quindi si comporta come un promotore forte ma presenta il vantaggio di incrementare
ulteriormente l’attività di trascrizione in risposta a stimoli ambientali.
I dati ottenuti indicano le grandi potenzialità del promotore HaHSP17.6b nell’ambito
biotecnologico, in futuro esso potrebbe infatti essere utilizzato per costruire biosensori per
il monitoraggio ambientale.

Plants respond to environmental stimuli, such as heat shock, by re-programming cellular
activity, mainly regulated at transcription level, that activate genes encoding specific
proteins (HSP). The object of this work is the analysis of genomic DNA region spanning
the two sunflower small HSP genes (HaHSP17.6a and HaHSP17.6b); these genes are
physically associated, arranged in tandem in head-to-head orientation and linked by a 3809
bp region. The regions encoding for these two genes show only slight structural differences,
in fact they differ for only 30 nucleotides, which give a eight aminoacid substitution in the
deduced aminoacidic sequence. However, they have a very different expression profile,
probabilis due to the fact that they are differently regulated, because of differences into
their promoters. By comparison of the intergenic region sequence with PLACE and
PlantCARE databases, it has been possible to definine the structure of this region
containing characteristic elements of plant HS promoters (TATA box, HSE, CCAAT box)
and other stress related cis-acting elements. These elements are present in different number
and positions in the upstream regions of the two genes and this could explain the
differences in their of HS response to different stresses. Functional analysis by progressive
deletions of the upstream region of the more responsive gene, HaHSP17.6b, was
performed in order to verify the functional role of the cis acting elements identified. Using
GFP as reporter gene different recombinant plasmids ware produced containing the
fragments obtained by progressive deletions of the region of interest. The recombinant
plasmid collection was used to carry out transient expression assays in N. tabacum
protoplasts, subjected to the various stresses.
The data obtained indicate that GFP gene expression is induced not only in response to
heat shock, but also under heavy metal, NaCl, cold and abscissic acid stresses. The higher
expression of GFP is obtained when it is under the control of the whole upstream region
(1682) of HaHSP17.6b. Howewer the transcription level does not decrease significantly
when constructs whit partial parts of the upstream region are used. Interestly the expression
level obtained whit HS promoter is comparable whit that of the CaMV35S strong promoter.
Thus, the HS promoter acts as a strong promoter but it has the ability to further increase
transcription activity in response to different environmental stimuli. This indicate that the
HaHSP17.6b promoter could be in the future utiliser as a powerful biotechnological tool
for instance to produce a biosensor for environmental monitoring.
Acknowledgments: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2409
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