Analisi funzionale di un promotore Heat Shock di girasole e sue applicazioni biotecnologiche

Abstract

Le piante rispondono agli stimoli ambientali, come lo stress da alte temperature (HS), mediante una riprogrammazione delle attività cellulari, regolata principalmente a livello trascrizionale, che prevede l’attivazione di geni che codificano per proteine specifiche (HSP). Oggetto di questo lavoro è l’analisi della regione di DNA genomico compresa tra due geni di girasole (HaHSP17.6a e HaHSP17.6b), che codificano per due HSP a basso peso molecolare, associati fisicamente, con orientamento invertito e separati da una regione intergenica di 3809 bp. Le regioni codificanti dei due geni presentano solo lievi differenze, essi differiscono solo per 30 nucleotidi che nella sequenza aa dedotta danno una sostituzione di solo 8 aa. Tuttavia, essi hanno un profilo di espressione molto differente ciò dipende con molta probabilità dal fatto che sono regolati in maniera diversa a causa di differenze nei loro promotori. Il confronto della sequenza della regione intergenica con quelle presenti nelle banche dati PLACE e PlantCARE, ha reso possibile definire la struttura di questa regione che contiene le sequenze che regolano l’espressione dei due geni. Mediante l’analisi in silico sono stati individuati gli elementi caratteristici dei promotori HS vegetali (TATA box, HSE, CCAAT box) e altri elementi cis-agenti coinvolti nella risposta ad altri tipi di stress. Tali elementi sono presenti in numero e in posizioni diverse nelle regioni a monte dei due geni e ciò potrebbe spiegare la notevole diversità nell’inducibilità dei due geni in risposta ai diversi stress. Per verificare il ruolo funzionale delle sequenze identificate è stata quindi effettuata un’analisi funzionale mediante delezioni progressive della regione a monte del gene più responsivo, HaHSP17.6b. Sono stati prodotti costrutti contenenti il gene reporter GFP, posto sotto il controllo dei frammenti di diversa lunghezza ottenuti dalla regione a monte di HaHSP17.6b. Questi plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per effettuare saggi di espressione transiente in protoplasti di Nicotiana tabacum sottoposti a stress diversi. I dati ottenuti indicano che l’espressione del gene GFP è indotta non solo in risposta alle alte temperature, ma anche in risposta allo stress da metalli pesanti, stress salino, da basse temperature e da acido abscissico. L’incremento dell’espressione di GFP è massimo quando esso è posto sotto il controllo di tutta la (1682 bp) a monte del gene HaHSP17.6b. Tuttavia il livello di trascrizione non decresce significativamente quando vengono utilizzati i costrutti contenenti porzioni parziali di questa regione. E’ interessante notare che il livello di espressione che si ottiene con il promotore HS è paragonabile a quello ottenuto utilizzando il promotore forte CaMV35S. Il promotore HS quindi si comporta come un promotore forte ma presenta il vantaggio di incrementare ulteriormente l’attività di trascrizione in risposta a stimoli ambientali. I dati ottenuti indicano le grandi potenzialità del promotore HaHSP17.6b nell’ambito biotecnologico, in futuro esso potrebbe infatti essere utilizzato per costruire biosensori per il monitoraggio ambientale.

Plants respond to environmental stimuli, such as heat shock, by re-programming cellular activity, mainly regulated at transcription level, that activate genes encoding specific proteins (HSP). The object of this work is the analysis of genomic DNA region spanning the two sunflower small HSP genes (HaHSP17.6a and HaHSP17.6b); these genes are physically associated, arranged in tandem in head-to-head orientation and linked by a 3809 bp region. The regions encoding for these two genes show only slight structural differences, in fact they differ for only 30 nucleotides, which give a eight aminoacid substitution in the deduced aminoacidic sequence. However, they have a very different expression profile, probabilis due to the fact that they are differently regulated, because of differences into their promoters. By comparison of the intergenic region sequence with PLACE and PlantCARE databases, it has been possible to definine the structure of this region containing characteristic elements of plant HS promoters (TATA box, HSE, CCAAT box) and other stress related cis-acting elements. These elements are present in different number and positions in the upstream regions of the two genes and this could explain the differences in their of HS response to different stresses. Functional analysis by progressive deletions of the upstream region of the more responsive gene, HaHSP17.6b, was performed in order to verify the functional role of the cis acting elements identified. Using GFP as reporter gene different recombinant plasmids ware produced containing the fragments obtained by progressive deletions of the region of interest. The recombinant plasmid collection was used to carry out transient expression assays in N. tabacum protoplasts, subjected to the various stresses. The data obtained indicate that GFP gene expression is induced not only in response to heat shock, but also under heavy metal, NaCl, cold and abscissic acid stresses. The higher expression of GFP is obtained when it is under the control of the whole upstream region (1682) of HaHSP17.6b. Howewer the transcription level does not decrease significantly when constructs whit partial parts of the upstream region are used. Interestly the expression level obtained whit HS promoter is comparable whit that of the CaMV35S strong promoter. Thus, the HS promoter acts as a strong promoter but it has the ability to further increase transcription activity in response to different environmental stimuli. This indicate that the HaHSP17.6b promoter could be in the future utiliser as a powerful biotechnological tool for instance to produce a biosensor for environmental monitoring.