Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2384
Title: Removal of unstable proteins from white wine by immobilized acid protease
Other Titles: Rimozione delle proteine instabili dai vini bianchi mediante proteasi acida immobilizzata
Authors: Benucci, Ilaria
Keywords: Wine proteins;Acid protease;Enzyme immobilization;Kinetic study;Proteine del vino;Proteasi acida;Immobilizzazione enzimatica;Studio cinetico;AGR/15
Issue Date: 17-Feb-2011
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 23. ciclo
Abstract: 
This PhD thesis research project was aimed at assessing and optimizing different
immobilization procedures of pineapple stem bromelain, in order to develop an
innovative biotechnological technique, alternative to bentonite fining, useful to removal
selectively unstable proteins from white wines.
Stem bromelain activity was assessed on a suitable synthetic substrate at a reference pH
value (3.2), this being the average minimum pH value of wine. Protease was covalently
immobilized on different supports by various procedures and the best biocatalyst was
chosen measuring immobilization percentage, kinetic parameters and half-life (in model
wine buffer). Moreover, the influence on free and immobilized protease activity of
potential inhibitors naturally present in wine, such as ethanol, tannins and sulphur
dioxide (SO2) over the average range concentration of wine, was investigated. Finally a
kinetic study was carried out using 6 artisan and unrefined white wines, spiced with the
synthetic substrate, in order to compare catalytic properties of free and immobilized
bromelain. Immobilized protease activity, then, was tested in these wines both on total
proteins and on unstable ones.
Covalent immobilization reduced bromelain catalytic properties. All kinds of
procedures applied at pH 7 allowed the highest immobilization yield. Nevertheless,
biocatalysts immobilized at pH 3.2 showed the best catalytic performance. Stem
bromelain was successfully immobilized on chitosan beads without glutaraldehyde at
pH 3.2, obtaining the most interesting and food-safe biocatalyst, which was used for all
other experiments.
Inhibition study proved that all the inhibitors tested resulted to be reversible for stem
bromelain activity. Nevertheless, the immobilized enzyme was lesser affect respect to
the free one. Free sulphur dioxide was the strongest inhibitor, being a mixed-type for
free stem bromelain and an uncompetitive inhibitor for the immobilized one.
Kinetic study of free and immobilized protease in different artisan and unrefined white
wines, showed that the catalytic efficiency of immobilized one, as measured with
respect to the synthetic substrate, paralleled that on wine proteins, varied depending on
the different inhibitors content in the tested wines.
In terms of turbidity haze, bromelain immobilized on chitosan beads exerted its useful
proteolytic activity on unstable white wine proteins in almost the same way whatever
their nature and content, in a 24-h treatment.

Questa tesi di dottorato ha avuto per oggetto l’applicazione e l’ottimizzazione di
differenti procedure per l’immobilizzazione di bromelina estratta da gambo d’ananas, al
fine di sviluppare una biotecnologia innovativa, alternativa al trattamento con bentonite,
in grado di rimuovere selettivamente le proteine instabili presenti nei vini bianchi.
L’attività della bromelina è stata valutata impiegando un substrato sintetico ad un pH di
riferimento (3.2), considerato il valore minimo medio di pH del vino. La proteasi è stata
immobilizzata covalentemente su differenti supporti applicando varie procedure e, fra i
biocatalizzatori ottenuti, è stato individuato quello migliore valutando la resa di
immobilizzazione, i parametri cinetici e l’emivita in vino modello. E’ stata inoltre
studiata l’influenza sull’attività della proteasi libera ed immobilizzata di potenziali
inibitori naturalmente presenti nel vino, quali etanolo, tannini e anidride solforosa
(SO2), testandone l’effetto nel range di concentrazione tipica del vino. Le proprietà
catalitiche della bromelina libera ed immobilizzata sono state, infine, confrontate
mediante uno studio cinetico, condotto in 6 differenti vini bianchi artigianali, arricchiti
con il substrato sintetico. In tali vini è stata poi valutata l’attività della proteasi
immobilizzata, sia sulle proteine totali che su quelle instabili.
Dai risultati ottenuti è emerso che l’immobilizzazione covalente ha inciso
negativamente sulle proprietà catalitiche della bromelina, indipendentemente dal pH di
immobilizzazione (3.2 o 7). Fra le procedure impiegate, quelle applicate a pH 7 hanno
permesso di ottenere le più alte rese d’immobilizzazione, anche se le migliori
performance catalitiche sono state rilevate per tutti i biocatalizzatori immobilizzati a pH
3.2. La bromelina da gambo d’ananas è stata immobilizzata con successo su sfere di
chitosano a pH 3.2 senza l’impiego di glutaraldeide, ottenendo così un biocatalizzatore
food-safe che, risultando il più interessante dal punto di vista catalitico, è stato
impiegato per i successivi esperimenti.
Lo studio di inibizione ha dimostrato che l’attività della proteasi è inibita in modo
reversibile da tutti i composti testati e che l’immobilizzazione ha reso l’enzima più
resistente alla loro azione. L’anidride solforosa ha ridotto notevolmente l’attività
catalitica della bromelina risultando, fra i composti testati, il più forte degli inibitori. La
sua azione inibente è risultata di tipo misto nei confronti della bromelina libera e
acompetitiva nei confronti di quella immobilizzata.
Dallo studio cinetico condotto nei vini bianchi artigianali, è emerso che la proteasi
immobilizzata esercita un’efficace azione catalitica sul substrato sintetico, così come nei
confronti delle proteine presenti nei vini testati, in modo diverso a seconda del loro
differente contenuto in inibitori.
In seguito ad un trattamento di 24-h, la bromelina immobilizzata su sfere di chitosano è
risultata inoltre utile nel rimuovere le proteine instabili presenti nei vini bianchi in
esame, indipendentemente dalla loro natura e dal loro contenuto.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologia degli alimenti
URI: http://hdl.handle.net/2067/2384
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