Analisi citogenetica della potenziale instabilità genetica in linee di frumento transgenico, comparate alla controparte wild type, in seguito ad insulti genotossici con agenti mutageni chimici e fisici

Abstract

Le piante geneticamente modificate sono organismi in cui il DNA è stato modificato, mediante tecniche di ingegneria genetica, attraverso l’inserzione di geni esogeni, provenienti anche da organismi evolutivamente molto distanti, allo scopo di migliorare particolari caratteristiche quali, ad esempio, resistenza a patogeni, a stress ambientali, aumento della produttività ecc. Le piante geneticamente modificate costituiscono una grande risorsa per le prospettive economiche e produttive che possono offrire nel futuro, tuttavia, accanto a queste caratteristiche vantaggiose esistono non pochi aspetti potenzialmente negativi correlati alla loro introduzione in agricoltura, nella nostra alimentazione ed alle imprevedibili interazioni a lungo termine con l’ambiente circostante. Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare la potenziale instabilità genetica intesa come maggiore suscettibilità ad accumulare danno genetico (in relazione ad aumentata inaccuratezza o inefficienza nella riparazione del DNA) in linee transgeniche di frumento, comparate alla loro controparte wild type in seguito ad insulti genetici con agenti chimici e fisici. Le sostanze utilizzate per il trattamento di tali linee producono lesioni al DNA attraverso differenti meccanismi d’azione e simulano il tipo di danno potenziale prodotto in natura da agenti esogeni: -Camptotecina: inibitore catalitico della DNA topoisomerasi I; induce esclusivamente rotture a singolo filamento del DNA; -Etoposide: inibitore catalitico della DNA topoisomerasi II; induce esclusivamente rotture a doppio filamento del DNA (DSB’s); -Raggi X: agente mutageno fisico; induce per ogni traccia di ionizzazione, rotture a singolo (SSB’s) e doppio filamento (DSB’s), eterogeneo danno alle basi, siti abasici, legami crociati DNA-DNA e DNA-proteine. -Raggi UV-C: agente mutageno fisico; induce specificamente dimeri di pirimidina e 6-4 fotoprodotti. Tali lesioni attivano differenti sistemi di riparazione del DNA che includono la riparazione da escissione dei nucleotidi, il sistema di riparazione delle rotture a singolo filamento del DNA, sistema di riparazione per ricombinazione omologa (HR) e non omologa (NHEJ). Gli ultimi due sistemi elencati provvedono alla riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA nelle differenti fasi del ciclo cellulare. Un tale approccio è giustificato dal fatto che l’inserzione casuale nel genoma di numerose copie di transgeni interi o frammenti dello stesso riarrangiati o rotti, determinando la presenza nel DNA di sequenze ad elevata omologia, in alcuni casi in stretta prossimità, può creare dei cosiddetti “hotspot di ricombinazione” con potenziali effetti destabilizzanti della molecola stessa. In diversi lavori condotti in piante di tabacco transgenico è stato osservato che le rotture a doppio filamento del DNA, indotte da agenti mutageni come raggi X, mitomicina-C e specifici enzimi di restrizione, localizzate in prossimità di sequenze omologhe ripetute, sono elettivamente riparate per ricombinazione omologa. Ciò indica che le piante possono rispondere ai suddetti “stress” con livelli marcatamente più elevati di ricombinazione omologa indotta, rispetto alle cellule di mammifero. In questo contesto, la rilevanza della formazione delle aberrazioni cromosomiche è legata al ruolo centrale delle rotture a doppio filamento del DNA sulle quali agiscono i processi di riparazione per ricombinazione non omologa e per ricombinazione omologa. L’analisi delle aberrazioni cromosomiche è stata condotta in seguito a trattamento con gli agenti mutageni selezionati, nelle cellule proliferanti del germoglio dei seguenti sistemi genetici: -Triticum aestivum (cultivar Bobwhite) dal quale, attraverso il metodo biolistico, sono state ottenute due differenti linee transgeniche: la linea denominata PGIP (che esprime la proteina PGIP della parete cellulare del fagiolo che aumenta la resistenza contro la fusariosi) e la linea denominata LMW-GS (caratterizzata dalla sovraespressione di una subunità gluteninica a basso peso molecolare). -Triticum durum (cultivar Svevo), trasformato con Agrobacterium tumefaciens per il silenziamento, attraverso il meccanismo dell’“RNA interference”, del gene “Starch branching enzyme IIa” coinvolto nella biosintesi dell’amilopectina, allo scopo di aumentare il contenuto di amilosio nell’endosperma. In aggiunta all’analisi delle aberrazioni cromosomiche, la potenziale instabilità genomica nelle linee di frumento transgeniche è stata valutata introducendo anche l’analisi dei “micronuclei” che permette di rilevare, insieme al danno cromosomico strutturale (aberrazioni cromosomiche) anche aberrazioni cromosomiche di tipo numerico (perdita cromosomica, non-disgiunzione). I risultati ottenuti indicano che le frequenze di aberrazioni cromosomiche, nonché le frequenze di micronuclei nelle linee transgeniche e nelle linee di controllo, non sono significativamente differenti. Ciò dimostra una sostanziale stabilità delle linee transgeniche dovuta ad una corretta riparazione delle rotture a doppio filamento indotte, in modo casuale, attraverso le differenti lesioni inflitte al DNA genomico dai diversi agenti mutageni impiegati.

The advent of GM technology in the early 1970s has determined to date, that over 30 million hectares of transgenic crops have been grown with the consequence that present day cultivated crops have become significantly different from their wild counterparts generated through classical plant breeding. Numerous potential concerns have been raised since the development of GM technology. Such concerns have focused on the potential for allergic reactions to food products, the possible introduction or increase in production of toxic compounds as a result of this technology, and the use of antibiotic resistance as markers in the transformation process. Very little is known about long term effects of ingestion of transgenic including their genomic stability. In the present study, we aimed to assess potential genomic instability of transgenic wheat lines exposed to physical and chemical genotoxic agents with different mechanisms of actions: -Camptothecin: catalytic inhibithor of DNA topoisomerase I which selectively induces DNA single strand breaks (SSB’s); -Etoposide: catalytic inhibithor of DNA topoisomerase II which selectively induces DNA doble strand breaks (DSB’s); - X-rays: induce SSB’s, DSB’s, abasic sites, base damage directly and indirectly by radiolysis of water; -Ultraviolet C radiation (UV-C): induces essentially pyrimidine dimers and 6-4-photoproducts The listed DNA lesions trigger many different DNA repair pathways including excision repair, DNA single strand break repair; homologous and non-homologous DNA end-joining etc.. Genetic instability has been evaluated by induction of chromosomal aberrations and micronuclei in proliferating cells of root tips of transgenic crops and their wild type counterparts following genetic damage. The following wheat lines have been used: The exaploid (42 chromosomes) Triticum aestivum transgenic by biolistic method for the line “LMW-GS” (low molecular weight glutenin subunits) which induce modification of the visco-elastic properties of the wheat doughs and the line “PGIP” (polygalactorunase inhibiting protein) which increased resistance to digestion of fungal PG. The tetraploid (28 chromosomes) Triticum durum transgenic by Agrobacterium tumefaciens with a single gene copy of RNA interference to silence the gene starch branching enzyme IIa (SBEIIa) for increase the amylose content, beneficial for human health effects.