Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2058
Title: Non-invasive diet analysis based on DNA Barcoding: the Himalayan Brown Bears (Ursus arctos isabellinus) as a case study
Authors: Valentini, Alice
Keywords: Diet analysis;Herbivorous;Non-invasive samples;DNA barcoding;Pyrosequencing;BIO/07
Issue Date: 7-Mar-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 20. ciclo
Abstract: 
The study of food webs and their dynamics is fundamental to understand how the
feeding habits of the different species can affect the community, thus improving our
understanding of the functioning of the ecosystem as a whole. Furthermore, the study of
feeding ecology becomes crucial when it concerns endangered species since a precise
knowledge of their diet is to be gathered when designing reliable conservation
strategies. A wide range of methodologies have been proposed for diet analysis,
including simple ones, as visual observation of foraging behavior, and more complex
ones such as Near Infrared Reflectance Spectroscopy and DNA based methods.
DNA barcoding, i.e. species identification using a standardized DNA region or
markers, has recently received much attention and is being further developed through an
international initiative called "Consortium for the Barcode of Life". When using DNA
barcoding for diet analysis, the choice of the markers is crucial. The ideal DNA
barcoding marker should meet several criteria. It should be variable among species,
standardized, with enough phylogenetic information, extremely robust, and short
enough to allow amplification of degraded DNA.
In this study we propose the trnL (UAA) intron as marker for plant DNA
barcoding. The power and the limitations of this system were evaluated as well as the
possibility of species identification with highly degraded DNA. The main limitation of
this system is its relatively low resolution in discriminating closely related species.
Despite the relatively low resolution, it has many advantages: the primers are highly
conserved, the amplification system is very robust and it is able to work with much
degraded DNA samples. This system has been coupled with massively parallel
pyrosequencing technique. We demonstrate the efficiency of this new approach by
analyzing the diet of various herbivorous species. The whole chloroplast trnL (UAA)
intron (254–767 bp) and a shorter fragment of this intron (the P6 loop, 10–143 bp) were
used in this study. For the whole trnL intron 67.3% of the species retrieved from
GenBank were unambiguously identified and 19.5% for the P6 loop. The resolution is
much higher after calibration of specific contexts using species originating from the
same ecosystem.
Furthermore, the trnL approach was coupled with individual and sex identification
using microsatellites polymorphism in the Himalayan brown bear (Ursus arctos
isabellinus). Among world brown bears populations; those in Asia are the most
ii
endangered and least studied. Here, populations have declined by more than half in the
past century owing to habitat loss and fragmentation and human activity. Presently in
Pakistan brown bear occur sparsely in seven small populations, with the largest isolate
in the Deosai National Park. We examined this population using a combination of fecal
DNA analysis and field data for which geographical location and date of sampling were
available, with the aim to study individual and sexual differentiation in the diet, and also
temporal and geographical variations. Twenty-eight individuals (16 male, 10 females
and 2 unknown sex) were identified in this study with microsatellites markers. Only
eight plant species were found represented in more than 50% of individual feces.
Temporal differences were found with more energetic food detected before the
hibernation periods.

Lo studio delle reti trofiche e della loro dinamica è fondamentale per comprendere come
le abitudini alimentari delle diverse specie possono incidere sulla comunità, migliorando
in tal modo la nostra comprensione sul funzionamento dell'ecosistema nel suo
complesso. Inoltre, lo studio dell’ecologia dell’alimentazione diventa cruciale quando si
tratta di specie in via d’estinzione, nelle quali una precisa conoscenza della loro dieta
deve essere acquisita per definire una strategia di conservazione di successo. Una vasta
gamma di metodi é stata proposta per l’analisi della dieta, che vanno da quelli più
semplici, come osservazione visiva dell’animale durante il pasto, a quelli più complessi,
come la Near Infrared Reflectance Spectroscopy e i metodi basati sul DNA.
Il DNA barcoding, cioè l’identificazione di attraverso una regione standardizzata
di DNA o attraverso marcatori, ha recentemente ricevuto molta attenzione e si è
ulteriormente sviluppato attraverso un'iniziativa del consorzio internazionale
denominato "Consortium for Barcoding of Life". Quando si usa il DNA barcoding per
l'analisi della dieta, la scelta dei marcatori è cruciale. Il marcatore ideale per il DNA
barcoding deve soddisfare diversi criteri. Deve essere variabile tra specie,
standardizzato, avente una sufficiente informazione filogenetica, molto robusto, e
abbastanza corto da consentire l'amplificazione di DNA degradato.
In questo studio si propone l'introne trnL (UAA) come marcatore per il DNA
barcoding delle piante. I vantaggi e gli svantaggi di questo sistema sono stati valutati
come pure la possibilità di identificare di specie da DNA molto degradato. Il limite
principale di questo sistema è la sua relativamente bassa risoluzione in discriminare
specie filogeneticamente molto simili. Nonostante la relativa bassa risoluzione, il
sistema ha molti vantaggi: i primers sono molto conservati, il sistema di amplificazione
è molto robusto ed è in grado di funzionare con campioni di DNA molto degradati.
Questo sistema è stato accoppiato con la tecnica di pirosequenziamento parallelo.
Abbiamo dimostrato l'efficacia di questo nuovo approccio analizzando la dieta di varie
specie d’erbivori. L'intero introne trnL (UAA) del cloroplasto (254-767 pb) e un breve
frammento di questo introne (il P6 loop, 10-143 pb) sono stati utilizzati in questo studio.
Per l'intero introne trnL, il 67,3% delle specie, recuperate da GenBank, sono statie
indentificate in modo inequivocabile e 19,5% per il P6 loop. La risoluzione è molto più
elevata dopo la calibrazione in contesti specifici utilizzando specie originarie dello
stesso ecosistema.
vi
Inoltre, il trnL approach è stato condotto in parallelo con identificazione degli
individui e del sesso dell’animale tramite microsatelliti nell’orso bruno imalaiano
(Ursus arctos isabellinus). Tra le popolazioni d’orso bruno al mondo, quelle in Asia
sono le più minacciate e meno studiate. Qui, le popolazioni sono diminuite di oltre la
metà nel secolo passato, a causa della frammentazione, la perdita di habitat e le attività
umane. Attualmente in Pakistan, l’orso bruno è presente in sette piccole popolazioni
isolate, con la più grande nel Parco Nazionale del Deosai. Abbiamo esaminato questa
popolazione utilizzando una combinazione d’analisi di DNA da feci e di dati di campo
per i quali la localizzazione geografica e la data di campionamento erano disponibili,
con l'obiettivo di studiare differenze nella dieta a livello individuale tra i due sessi, e
anche variazioni geografiche e temporali. Ventotto individui (16 maschi, 10 femmine e
2 di sesso sconosciuto) sono stati identificati in questo studio con i marcatori
microsatelliti. Solo otto specie di piante sono state trovate rappresentate per oltre il 50%
degli individui. Differenze temporali sono state riscontrate, con un consumo di cibo più
energtico prima del periodo del letargo.

L'étude des réseaux trophiques et leur dynamique est fondamentale pour comprendre
comment les habitudes alimentaires des différentes espèces peuvent influencer la
communauté, afin d'améliorer notre compréhension du fonctionnement de l'écosystème
dans son ensemble. En outre, l'étude de l'écologie alimentaire devient cruciale lorsqu'il
s'agit des espèces en voie de disparition, une connaissance précise de leur alimentation
doit être acquise lors de la conception des stratégies de conservation. Un large éventail
de méthodes a été proposé pour l’analyse du régime alimentaire, y compris les plus
simples, comme l'observation visuelle du comportement d’alimentation, et les plus
complexes, comme la spectrométrie dans le proche infrarouge et les méthodes basées
sur l'ADN.
"DNA barcoding" (Code barre d’ADN), c'est-à-dire l'identification des espèces en
utilisant une région standardisée d'ADN ou des marqueurs standardisés, a récemment
reçu beaucoup d'attention et est actuellement développé grâce à une initiative
internationale appelée "Consortium for The Barcoding of Life". Lors de l'utilisation du
"DNA barcoding" pour le régime alimentaire, le choix des marqueurs est crucial. Le
marqueur idéal pour le "DNA barcoding" doit satisfaire plusieurs critères. Il doit être
variable entre les espèces, standardisé, avec suffisamment d'informations
phylogénétiques, très robuste, et suffisamment court pour permettre l'amplification de
l’ADN dégradé.
Dans cette étude, nous proposons l’intron trnL (UAA) en tant que marqueur pour
le "DNA barcoding" des plantes. Le pouvoir et les limites de ce système ont été évalués,
ainsi que la possibilité d'identification des espèces avec de l'ADN fortement dégradé. La
principale limitation de ce système est la relative faible résolution de discrimination des
espèces très proches. En dépit de la résolution relativement faible, elle présente de
nombreux avantages: les amorces sont hautement conservées, le système d'amplification
est très robuste et il est capable de travailler avec des échantillons d'ADN très dégradés.
Ce système a été couplé avec la technique du pyroséquençage. Nous avons démontré
l'efficacité de cette nouvelle approche par l'analyse de l'alimentation de différentes
espèces herbivores. L'ensemble des introns chloroplastique trnL (UAA) (254-767 pb) et
d'un court fragment de cet intron (P6 boucle, 10-143 pb) ont été utilisés dans cette
étude. Pour l'ensemble de l’intron trnL, 67,3% des espèces récupérées à partir de
GenBank ont été identifiées sans ambiguïté et 19,5% pour la P6 boucle. La résolution
iv
est beaucoup plus élevée après calibration sur des contextes spécifiques en utilisant des
espèces originaires d'un même écosystème.
En outre, l’approche par le trnL a été associée à l'identification individuelle et le
sexe en utilisant le polymorphisme de microsatellites dans l’ours brun himalayen (Ursus
arctos isabellinus). Parmi les populations mondiales d'ours bruns, celles d’Asie sont les
plus menacées et les moins étudiées. Ici, les populations ont diminué de plus de moitié
au cours du siècle dernier en raison de la perte d'habitats, de sa fragmentation et de
l'activité humaine. Actuellement, au Pakistan l'ours brun existe dans sept petites
populations isolées, dont la plus grande est située dans le Parc National du Deosai. Nous
avons examiné cette population au moyen d'une combinaison de l'analyse d'ADN des
fèces et de données de terrain pour lesquelles les coordonnées géographiques et la date
de prélèvement étaient disponibles, pour étudier la différenciation sexuelle et
individuelle du régime alimentaire, ainsi que les variations temporelles et
géographiques. Vingt-huit individus (16 mâles, 10 femelles et 2 de sexe inconnu), ont
été identifiés dans cette étude avec les marqueurs microsatellites. Seulement huit
espèces de plantes ont été trouvées représentées dans plus de 50% des fèces des
individus. Des différences temporelles ont été trouvées, avec une alimentation plus
énergétique avant la période d'hibernation.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche
URI: http://hdl.handle.net/2067/2058
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