Identification and characterisation of new members of pectin methylesterase/invertase inhibitor family in tomato (Solanum lycopersicum)

Abstract

Pectin methylesterase (PME) and invertase (INV) are key enzymes in plant carbohydrate metabolism. An important post-transcriptional mechanism of regulation of these enzymes is represented by proteinaceous inhibitors. PME inhibitors (PMEI) and INV inhibitors (INH), belong to the same structural family Pf 04043. Despite the structural similarity, these two inhibitors act on two structurally and functionally different enzymes, but never both. Both inhibitors do not inhibit fungal enzymes indicating that they are mainly involved in growth and development even if they seems to be also involved in defence against pathogens. In this thesis through a functional genomics approach a pectin methylesterase inhibitor (SolyPMEI) and an invertase inhibitor (SolyCIF) of Solanum lycopersicum have been identified and characterised. SolyPMEI was mainly expressed in red fruits and, albeit at lower levels, in flowers and pollen. The SolyPMEI cDNA was cloned and expressed in Pichia pastoris. All attempts to produce active recombinant SolyPMEI protein appeared to be unsuccessful, neverthless CD spectra and disulfide bridges indicated a correct folding of the protein in vitro. The immuno-affinity fishing approach was used to purify the natural SolyPMEI from tomato fruits. The isolation of both natural SolyPMEI and PME-1 indicated that SolyPMEIs is in vivo engaged in the formation of a stable complex with endogenous PMEs. SolyCIF was mainly expressed in leaves, flowers and green fruits of the plant and localized in the cell wall compartment. The SolyCIF cDNA was cloned and expressed in Pichia pastoris. The purified recombinant protein was biochemically characterized. The invertase activity was strongly inhibited in a dose-dependent manner by recombinant SolyCIF.With an affinity chromatography approach, the natural ligand of the inhibitor (the vacuolar invertase namely TIV-1) was purified and characterised. TIV-1 has been shown to be naturally proteolyzed and it was established that the fragments produced have to be tightly associated for its enzymatic activity to occur. N- terminal sequencing of fragments and the molecular model of TIV-1 shows that the fragmentation splits the catalytic site of the enzyme into two halves, which confirms that the enzymatic activity is possible only when the fragments are tightly associated.

La pectina metilesterasi (PME) e l’invertasi (INV) sono due enzimi chiave del metabolismo dei caboidraiti nelle piante. Oltre al controllo a livello trascrizionale, un importante meccanismo di regolazione dell’attività di questi enzimi è svolto da specifici inibitori proteici. Gli inibitori di invertasi (INH) e di pectina metilesterasi (PMEI) sono degli inibitori proteici raggruppati nella famiglia Pf 04043 in quanto condividono numerose proprietà strutturali. Nonostante queste similitudini strutturali, i diversi inibitori interagiscono in modo specifico con enzimi funzionalmente e strutturalmente diversi. Entrambi gli inhibitori non agiscono su enzimi prodotti da patogeni, indicando un ruolo prevalente nei processi di sviluppo, anche se sembrano partecipare nella difesa delle piante da patogeni. In questa tesi, attraverso un approccio di genomica funzionale, un inibitore di PME (SolyPMEI) e un inibitore di INV (SolyCIF) sono stati identificati e caratterizzati in pomodoro (Solanum lycopersicum). SolyPMEI ha mostrato essere molto espresso in frutto rosso e, a bassi livelli, anche in fiori e polline. Il cDNA del SolyPMEI è stato clonato ed espresso in Pichia pastoris. Tutti i tentativi di produrre una proteina ricombinante attiva sono stati vani sebbene, l’analisi CD e dei ponti dusilfuro, rivelassero un corretto ripiegamento della proteina in vitro. Al fine di purificare l’inibitore naturale da bacca di pomodoro, è stata realizzata una colonna d’immuno-affinità. L’eluizione sia dell’inibitore sia della PME-1 di pomodoro, indica che in vivo, SolyPMEI è coinvolto nella formazione di un complesso stabile con le PME endogene. SolyCIF è una proteina apoplastica espressa nelle foglie, nei fiori e nei frutti verdi. Il cDNA del SolyCIF è stato clonato ed espresso in Pichia pastoris e la proteina ricombinante, è stata purificata e caratterizzata biochimicamente L’invertasi di pomodoro era fortemente inibita in maniera dose dipendente dal SolyCIF. Il partner naturale dell’inibitore (l’invertasi vacuolare TIV-1) è stato purificato con una colonna di affinità e caratterizzato biochimicamente. TIV-1 mostrava diversi siti di proteolisi naturali. I frammenti che compongono TIV-1 interagiscono tra loro permettendo all’enzima di funzionare. Il sequenziamento N-terminale dei frammenti e analisi di modeling di TIV-1 mostrano che il sito attivo del’enzima è diviso in due, confermando che l’idrolisi del saccarosio avviene solo quando i frammenti sono associati tra loro.