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Title: Produzione di vanillina “naturale” mediante l’uso di biocatalizzatori microbici
Authors: Luziatelli, Francesca
Keywords: Vanillina;Bioconversione;Acido ferulico;E. coli Pseudomonas;CHIM/11
Issue Date: 14-Mar-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 20. ciclo
Abstract: 
Questo progetto di dottorato ha riguardato lo sviluppo, mediante tecniche di ingegneria metabolica, di ceppi microbici idonei per la produzione biotecnologica di vanillina da acido ferulico. L’aldeide vanillica, o vanillina, è la molecola che impartisce all’ aroma di vaniglia il suo tipico profumo e rappresenta uno dei principali composti aromatizzanti impiegati nell’industria alimentare. Dal momento che l’aroma estratto da fonti naturali (i baccelli curati della Vanilla planifolia) è un ingrediente molto costoso (1.400 $/Kg) e poco abbondante, nei prodotti aromatizzati alla vaniglia (alimenti compresi) si utilizzata quasi esclusivamente vanillina ottenuta per sintesi chimica. L’impiego di microrganismi per la produzione biotecnologia di vanillina permetterebbe di ottenere, partendo da materie prime naturali (come acido ferulico, eugenolo o capseicina), un prodotto etichettabile come “naturale” che potrebbe essere alternativo sia all’aroma ottenuto per via estrattiva che all’additivo ottenuto per sintesi. Per rendere competitivo un processo biotecnologico, per la produzione di vanillina, è fondamentale che i biocatalizzatori che si intende utilizzare siano geneticamente stabili, (essendo la vanillina è un prodotto tossico) ed efficienti. Poiché la vanillina è un intermedio del catabolismo dell’acido ferulico (un composto fenilpropenoico presente in quantità significativa nel materiale lignocellulosico), avvalendosi, di tecniche di ingegneria metabolica, la capacità di convertire l’acido ferulico in vanillina, può essere conferito sia a ceppi in grado di degradare l’acido ferulico che a ceppi incapaci di degradare l’acido ferulico in vanillina. In questo lavoro di tesi, per sviluppare un processo competitivo di conversione dell’acido ferulico in vanillina, sono stati utilizzati due diversi biocatalizzatori: un mutante del ceppo P. fluorescens BF13, che ha perso la capacità di ossidare l’aldeide vanillica ad acido vanillico e accumula aldeide vanillica in presenza di acido ferulico; un ceppo di Escherichia coli, sviluppato appositamente nell’ambito di questo lavoro di tesi, al quale è stato conferito la capacità di convertire l’acido ferulico in vanillina. La conversione dell’acido ferulico in vanillina è stata ottenuta utilizzando cellule resting, ottimizzando le condizioni di coltivazione della biomassa(terreno di crescita, fonte di carbonio e modalità di crescita), le condizioni di bioconversione (composizione e pH del tampone di bioconversione e temperatura di incubazione) e le modalità di conservazione del biocatalizzatore. Su collaborazione con la GNOSIS S.p.A. con il ceppo ingegnerizzato di P. fluorescens sono state effettuate, con successo, prove di scale-up in fermentatore da 15-L utilizzando materie prime di grado industriale per la preparazione del terreno di crescita e del mezzo di bioconversione. Utilizzando il ceppo ingegnerizzato di E. coli, è stata ottenuta una produzione di 6,6 g di vanillina per litro di coltura, che rappresenta la produttività di vanillina più alta fino ad ora raggiunta con ceppi di E. coli.

This doctoral project deals with the development of metabolically engineered strains for the production of vanillin from ferulic acid. Vanillic aldehyde, or vanillin, is the molecule that gives vanilla its typical aroma and one of the main compounds used in food flavouring. As the natural aroma extracted from Vanilla planifolia pods is very expensive (1400 $/kg) and rare, chemically synthesized vanillin is used almost exclusively in vanilla-flavoured products (including food). “Biotech-vanillin” produced by microorganisms from natural raw materials such as ferulic acid, eugenol or capsaicin, would allow for a natural alternative to both natural vanilla extract and synthetically produced vanillin. To make the biotechnology process economically competitive, it is essential that the biocatalysts used for the production of vanillin are stable and as efficient as possible. Since vanillin is an intermediate product of the ferulic catabolism, a compound phenylpropanoic acid present in significant quantities in the lignocellulosic material, the aim of this thesis was to compare two microbial biocatalysts able to produce vanillin starting from ferulic acid, using two alternative strategies. The first biocatalyst was the Pseudomonas fluorescens strain BF13 which is able to naturally degrade ferulic acid and was previously identified in the biotechnology laboratory at the University of Tuscia. A site-specific mutation was introduced into the gene coding for vanillin dehydrogenase of P. fluorescens strain BF13, resulting in a mutant able to convert ferulic acid into vanillin, but unable to oxidise vanillic acid. The second biocatalyst was obtained from a bacterium (Escherichia coli) unable to use the vanillin and ferulic acid as sources of carbon. Through metabolic engineering, the ability to produce the enzymes needed to transform ferulic acid into vanillin was conferred onto the E. coli strain. The ability of the two microorganisms to efficiently produce vanillin starting from ferulic acid was evaluated in experiments conducted by means of bioconversion with resting cells. Particular attention was paid to the cost of production of biomass which could significantly impact overall costs of the vanillin-production process. Optimal growth conditions (substrate and source of carbon, temperature growth, growth phase) and biomass use (composition of the bioconversion buffer, temperature and pH of the process, pre-treatment of biomass) were identified for both microorganisms.
Successful tests for commercial production of vanillin were carried out for GNOSIS S.p.A., a company interested in the transfer of the process on an industrial scale. Industrial grade raw materials in a 15-L fermentor were use for the preparation of the growth strain and for bioconversion. The best results were obtained by the engineered strain of E. coli, which produced 6.6 g of vanillin/L of culture. This value represents the highest production of vanillin obtained to date using biocatalysts from E . coli.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie degli alimenti
URI: http://hdl.handle.net/2067/1988
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