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Title: Ritardo di sviluppo di coorti di Xenopus laevis in prometamorfosi esposte a campi magnetici a bassa frequenza e confronto del contenuto di melatonina retinica tra esposti e controlli
Authors: Alilla, Roberta
Keywords: Ritardo di sviluppo;Campi magnetici ELF;Melatonina;BIO/06
Issue Date: 4-Apr-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca 20. ciclo
Abstract: 
Ritardo di sviluppo di coorti di Xenopus laevis in prometamorfosi esposte a campi
magnetici a bassa frequenza e confronto del contenuto di melatonina retinica tra esposti
e controll.
Lo scopo della mia Tesi di Dottorato di Ricerca era di confermare, mediante esperimenti,
che l’esposizione di girini di Xenopus laevis (Daudin) a deboli campo a bassa frequenza
può rallentare lo sviluppo ontogenetico di questi animali, verificare l’esistenza di
particolari combinazioni di ampiezza-frequenza del campo magnetico in grado di
promuovere questo fenomeno, e tentare, sempre sperimentalmente, di comprendere se la
melatonina possa avere il ruolo di molecola ‘target’ per l’energia magnetica. Ho proposto
questa ricerca sulla base dei risultati di una precedente, in cui il mio tutor aveva osservato
un ritardo significativo (P <0.001) della metamorfosi in girini di X. laevis esposti al campo
magnetico di un apparecchio televisivo[Severini et al., 2003]. E’ noto che il televisore
possiede un campo magnetico con forma d’onda a ‘dente di sega’, costituito da differenti
componenti armoniche; pertanto, non è possibile definire quale combinazione(i) di
frequenza-ampiezza emessa dal televisore è responsabile del ritardo di maturazione
osservato. Al fine di comprendere il ruolo delle differenti combinazioni di frequenzaampiezza
nel causare ritardo di sviluppo in X. laevis, è stato progettato e costruito un
solenoide in cui potessero essere posizionati gli acquari contenti i girini per esposizioni
prolungate. Impiegando questo solenoide come sorgente di campo magnetico sono stati
eseguiti sei esperimenti: tre durante il primo anno ed i restanti tre durante il secondo. Nel
terzo anno, quando è stato preso in considerazione il ruolo della melatonina, i girini sono
stati esposti al campo magnetico emesso da un apparecchio televisivo, come nei precedenti
esperimenti condotti da Severini.
Nei tre esperimenti del primo anno, sono state allevate quattro coorti di 35 girini in
acquari nelle stesse condizioni (di temperatura, disponibilità d’acqua, dieta e fotoperiodo).
Due delle quali erano esposte all’interno del solenoide a due combinazioni leggermente
differenti di frequenza ed intensità del campo magnetico: (50 Hz, 71.1 μT rms) e (50 Hz,
73.7 μT rms), rispettivamente. Le alter due coorti, quelle di controllo, erano esposte al
campo geomagnetico statico (20,6 μT) ed al campo variabile di fondo (0.05 μT) [Severini,
Alilla et al., in review]. I risultati dell’analisi statistica ANOVA a due vie mostrano che il
campo magnetico ELF più intenso (73.7 μT rms) causa un ritardo di sviluppo altamente
significativo (4.05 giorni, P <0.001) rispetto ai controlli, mentre il ritardo dovuto al campo
più debole (71.1 μT rms) è inferiore (1.57 giorni) e non significativo (P < .40). Questo
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risultato non conferma solo che l’esposizione al campo magnetico rallenta lo sviluppo dei
girini, ma suggerisce inoltre l’esistenza di una soglia di intensità tra 71 μT rms e 74 μT rms
(rispettivamente di ampiezza 100 μT e 104 μT) associata all’esposizione dei girini ad un
campo magnetico a 50 Hz.
In ognuno dei tre esperimenti del secondo anno, due coorti erano esposte alle stesse
combinazioni di frequenza-ampiezza del campo generato all’interno del solenoide: (50 Hz,
71.1 μT rms) and (50 Hz, 73.7 μT rms) con una sola differenza rispetto agli esperimenti del
primo anno. Nella prima serie il campo statico (geomagnetico) era (20,6 μT), nella seconda
il campo statico all’interno del solenoide è stato aumentato fino a raggiungere 65 μT.
Questa operazione è stata eseguita per condurre la seconda serie di esperimenti in
condizioni di risonanza di ciclotrone del Ca2+, in accordo con la teoria di Liboff [Liboff,
1985], e capire se questa teoria può spiegare (almeno in parte) i ritardi osservati. I risultati
mostrano che il campo magnetico alla frequenza di risonanza di ciclotrone del Ca2+ ha
prodotto un ritardo di sviluppo significativo (0.86 days, P<.05), benché inferiore a quello
della prima serie. Confrontando i risultati dell’ultima serie di esperimenti con quelli della
prima, possiamo escludere che gli ioni calcio giochino un ruolo importante nel ritardare la
metamorfosi in condizioni di risonanza. Ciò è in accordo con la critica principale alla
teoria di Liboff, per la quale l’agitazione termica delle molecole nella materia distrugge gli
effetti della risonanza di ciclotrone [Adair, 1991]. In conclusione, gli ioni calcio non
possono essere considerati come molecole ‘target’ dei fotoni elettromagnetici nella materia
biologica.
Nel tentative di trovare un mediatore biologico tra la radiazione elettromagnetica ad onda
lunga ed il ritardo di sviluppo, il terzo anno della mia ricerca è stato dedicato ad indagare il
ruolo svolto dalla melatonina. Negli Anfibi, la metamorfosi è indotta da una graduale
crescita dell’ormone tiroideo (TH) fino a raggiungere un picco al climax metamorfico. La
melatonina ha un effetto inibitorio diretto sull’ormone tiroideo in tutti gli stadi di sviluppo
[Wright et al., 2000] and ed è considerata un mediatore dell’azione dei campi
elettromagnetici [Reiter, 1998]. Nei miei due esperimenti ho esposto una coorte di girini di
X. laevis al campo magnetico emesso da un apparecchi televisivo, come negli esperimenti
di Severini [2003].
Gli espianti delle retine di Xenopus sono iniziate durante la prometamorfosi circa allo
stadio 55, secondo la classificazione di Nieuwkoop & Faber [1956], e le concentrazioni di
melatonina sono state determinate mediante un test ELISA (IBL-Hamburg). I risultati
mostrano che nelle retine di Xenopus la melatonina presenta un ritmo circadiano di sintesi
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con livelli elevate di notte e livelli bassi di giorno. Fino ad ora, era noto che le retina di X.
laevis sintetizzasse e rilasciasse la melatonina miticamente in stadi precoci della vita
embrionale e larvale (26 e 47) [Green et al,. 1999]; i nostri risultati mostrano che ciò
avviene anche in prometamorfosi. L’esposizione al campo magnetico del televisore ha
causato un rallentamento dello sviluppo già rilevabile tre settimane dopo l’oviposizione,
tuttavia, la differenza tra le concentrazioni di melatonina degli esposti e dei controlli non
risulta significativa. E’ noto che le concentrazioni di melatonina diminuiscono quando i
girini di X. laevis si avvicinano alla metamorfosi, e presumibilmente, anche le differenze
tra esposti e non esposti tendono a diminuire. Come conseguenza, il numero di retine
espiantate deve aumentare nell’intento di mostrare una differenza tra la concentrazione di
melatonina retinica dei girini esposti e non.

Developmental delay of Xenopus laevis cohorts in prometamorphosis exposed to weak
low frequency magnetic fields and comparison of retina’s melatonin concentration
between exposed and control cohorts.
Objective of my doctor’s degree thesis was to confirm by experiments that exposure of
Xenopus laevis (Daudin) tadpoles to weak low frequency magnetic fields can slow down
animal’s ontogenetic development, to check particular amplitude-frequency combinations
of magnetic fields in promoting this phenomenon, and to attempt, still through
experiments, understanding if melatonin can be considered as a target molecule of
magnetic energy. I proposed this research starting from the results of a previous one, in
which my tutor observed a significant (P <0.001) metamorphosis delay in X. laevis
tadpoles exposed to the magnetic field of a TV set [Severini et al., 2003]. It is well known
that TV magnetic field has a ‘saw-tooth’ shape, and that it consists of different harmonic
components; then, it is not possible to ascertain which frequency-amplitude combination(s)
of TV magnetic field is responsible of the observed maturation retard. In order to check
the role of different amplitude-frequency magnetic field combinations in causing X. laevis
developmental retard, a tuneable solenoid in which aquariums with tadpoles can be lodged
for long (toxic) exposures was planned and constructed. With this solenoid as magnetic
field source were performed six experiments: three in the first year and the remaining three
in the second. In the third year, when the role of melatonin was taken into consideration,
tadpoles were exposed to a magnetic field emitted from a TV device, as in the former
Severini’s experiments.
In the three experiments of the first year, four cohorts of 35 tadpoles were reared in
aquariums in comparable conditions (of temperature, water availability, feeding and
photoperiod). Two of them were exposed inside the solenoid to two slightly different
combination of magnetic field frequency and intensity: (50 Hz, 71.1 μT rms) and (50 Hz,
73.7 μT rms), respectively. The remaining two cohorts, the control ones, were exposed to
static geomagnetic field (20,6 μT) and background variable field (0.05 μT) [Severini,
Alilla et al., in review]. The statistical analysis of results via two way ANOVA shows that
the strongest ELF magnetic field (73.7 μT rms) causes a highly significant metamorphosis
delay (4.05 days, P < 0.001) with respect to the controls, whereas the retard caused from
the weakest one (71.1 μT rms) is smaller (1.57 days) and not significant (P <.40). This
result not only confirms that magnetic exposure can slow down tadpoles development, but
it also suggests that a sharp intensity threshold between 71 μT rms and 74 μT rms
115
(amplitude 100 μT and 104 μT) must exist in considering developmental retards associated
to exposures to 50 Hz electromagnetic fields.
In each of the three experiments of the second year, two cohorts were exposed to the same
frequency-intensity combinations of magnetic field in the solenoid: (50 Hz, 71.1 μT rms)
and (50 Hz, 73.7 μT rms) with the following difference as to the first year. Then, the
constant static (geomagnetic) field was (20,6 μT), while in the new series of experiments
the constant static magnetic field in the solenoid was augmented artificially up to 65 μT.
This was done to perform this series of experiments in condition of Ca2+ cyclotron
resonance, according to Liboff’s theory [Liboff, 1985] and to check if this theory could
explain (at least partially) the observed retards. The results show that the magnetic field
Ca2+ cyclotron resonance produced a significant developmental delay (0.86 days, P<.05),
though shorter than that of the first series. Comparing the results of the last three
experiments in the solenoid to the former three, we can exclude that calcium ions play an
important role in retarding metamorphosis via cyclotronic resonance. This is in agreement
with the main criticism of the Liboff’s theory, according to which thermal molecular
agitation in matter destroys the effects of cyclotronic resonance [Adair, 1991]. In
conclusion, cellular calcium ions cannot be considered as target molecules of
electromagnetic photons in biological matter.
In attempt to find a biological mediator between electromagnetic long wave radiation and
developmental delay, the third year of my research was dedicated to investigate the role of
melatonin. In Amphibians, metamorphosis is induced by a gradual rise in the thyroid
hormones (TH) that get to their maximum values during metamorphic climax. Melatonin
has an inhibitory effect on the thyroid hormones in all stages of the life cycle [Wright et
al., 2000] and it is considered a mediator of electromagnetic fields [Reiter, 1998]. In my
two experiments I exposed a cohort of X. laevis tadpoles to the magnetic field emitted by a
TV set, as in Severini’s experiment [2003].
Removal of Xenopus retinas started during animal’s prometamorphosis about at stage 55,
according to Nieuwkoop & Faber classification [1956], and melatonin concentrations was
measured by the ELISA (IBL-Hamburg) test. The results show that melatonin in Xenopus
retinas has a circadian rhythm of synthesis with high levels at night and low levels during
the day. Up to now, it was known that X. laevis retinas synthesize and release melatonin
rhythmically in early embryonic and larval stages (26 and 47) [Green et al,. 1999]; our
results show that this happens also in prometamorphosis. The exposure to the TV set
magnetic field caused a developmental slow down already significant three weeks after
116
oviposition, however, the difference between melatonin concentrations of exposed and
unexposed cohorts does not result significant. It is known that melatonin concentrations
decrease as X. laevis tadpoles approach metamorphosis, and presumably, differences in
melatonin concentrations between exposed and not exposed tadpoles progressively
diminish. As consequence, the number of removed retinas must increase with respect to as
we did in order to show a difference of retinal melatonin concentration between exposed
and not exposed tadpoles.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/1980
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