Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/1967
Title: Ischemia retinica: studi morfologici e funzionali
Authors: Catalani, Elisabetta
Keywords: Ischemia;Retina;SRIF;BIO/09
Issue Date: 4-Apr-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 20. ciclo
Abstract: 
L’ischemia è la principale causa di morte neuronale in retine colpite da patologie. I tipi
di recettori di neurotrasmettitori e di neuropeptidi espressi dai neuroni retinici potrebbero
determinare la risposta di questi stessi al danno ischemico. Un nuovo modello di ischemia
retinica nel topo è stato utilizzato per studiare la risposta all’ischemia da parte di retine con
un’alterata espressione dei recettori della somatostatina (SRIF). In questo studio sono state
utilizzate retine knock out (KO) per il recettore sst1 della SRIF, nelle quali il recettore sst2 è
sovra-espresso e più funzionale, e retine sst2 KO. L’analisi TUNEL effettuata su retine
ischemiche ha mostrato una marcata riduzione della morte cellulare in retine sst1 KO rispetto
a retine wild-type (WT) mentre nessuna differenza è stata osservata in retine sst2 KO. Anche
l’espressione dell’mRNA relativo alla caspasi-3 risulta minore nelle retine sst1 KO rispetto al
WT. L’analisi immunoistochimica ha mostrato che differenti popolazioni cellulari rispondono
diversamente all’insulto ischemico e che la marcatura relativa ad alcuni marker
immunoistochimici persiste maggiormente nelle retine sst1 KO che nel WT o nelle retine sst2
KO. In particolare, le cellule bipolari dei bastoncelli mostrano una particolare resistenza al
danno ischemico nelle retine sst1 KO, mentre la loro sopravvivenza diminuisce notevolmente
nelle retine sst2 KO. Inoltre, in accordo con le osservazioni circa il ruolo che l’eccito-tossicità
da glutammato esercita nell’indurre morte neurale in condizioni di ischemia, il rilascio di
glutammato aumenta notevolmente in condizioni ischemiche, ma esso aumenta in misura
nettamente inferiore in retine sst1 KO. Queste osservazioni dimostrano che la sovraespressione
dei recettori sst2 protegge la retina dall’ischemia e supportano l’idea dell’uso di
analoghi dei recettori sst2 come agenti terapeutici in malattie retiniche come ad esempio il
glaucoma o la retinopatia diabetica. Sulla base di queste evidenze, abbiamo verificato l’ipotesi
che la stimolazione dei recettori sst2 con ligandi esogeni potesse garantire maggiore
protezione nei confronti dell’insulto ischemico. Retine WT ed sst1 KO, sono state incubate in
vitro per 1h in una soluzione ischemica contenente 10-5M di SRIF o di octreotide (un agonista
dei recettori sst2) o di SOM230 (un analogo della SRIF). Come ci si aspettava, in assenza di
trattamento farmacologico la morte cellulare risulta ridotta in retine ischemiche sst1 KO
rispetto a retine ischemiche WT. Inoltre, la SRIF, l’octreotide o la SOM230, in retine
ischemiche WT, riducono la morte cellulare. Sorprendentemente, però, nelle retine sst1 KO,
questi trattamenti fanno aumentare la morte cellulare invece di conferire maggiore protezione
ai neuroni retinici come era atteso. I nostri dati indicano che, sebbene i recettori sst2 attivati
conferiscano protezione alle retine ischemiche, esistono dei limiti a tali effetti che possono
essere anche dannosi. Questi limiti possono essere dovuti alla desensitizzazione dei recettori o
a modulazione delle vie di trasduzione. I recettori sst2, come gli altri recettori della SRIF,
sono recettori accoppiati a proteine G, quindi sono state studiate molecole che regolano
l’attività di proteine G in retine ischemiche WT ed sst1 KO . In particolare, è stata studiata
l’espressione dell’mRNA di proteine GRK (G protein-coupled receptor kinases) ed RGS
(regulators of G protein signaling) in retine WT o sst1 KO normali ed ischemiche dopo
trattamento farmacologico. Le retine WT esprimono i sottotipi GRK1 e GRK2, RGS1, RGS2,
RGS5 ed RGS9. In seguito ad ischemia le proteine GRK1 ed RGS1 mostrano un significativo
aumento della loro espressione, quindi l’espressione di queste due molecole è stata studiata in
retine ischemiche trattate con octreotide. L’espressione dell’mRNA per le proteine GRK1 ed
RGS1 in retine ischemiche WT trattate con octreotide risulta significativamente inferiore
rispetto a quella osservata in retine ischemiche WT non trattate. In retine ischemiche sst1 KO
trattate con octreotide è stata osservata una diminuzione dell’espressione dell’mRNA per le
proteine GRK1 simile a quella osservata nel WT sebbene i livelli di espressione dell’mRNA
per le proteine RGS1 rimanga pressocchè invariata rispetto alle retine ischemiche sst1 KO
non trattate. La persistenza di livelli elevati di espressione di fattori regolatori in retine sst1
KO trattate con octreotide potrebbe inibire la risposta dei recettori sst2 e potrebbe essere
responsabile, almeno in parte, degli effetti dannosi dell’octreotide osservati in retine
ischemiche sst1 KO.
L’ipossia è la causa primaria dell’ischemia retinica ed inoltre provoca una risposta
neoangiogenetica responsabile di serie patologie retiniche. Dati recenti indicano che la
neoangiogenesi è contrastata dalla SRIF attraverso i suoi recettori sst2. Utilizzando un
modello in vivo di ipossia nel topo, abbiamo verificato l’ipotesi che l’adenilato-ciclasi (AC)
sia coinvolta nelle azioni anti-angiogeniche della SRIF. L’ipossia induce l’aumento dei livelli
di AC nelle retine WT ed in quelle in cui manca il recettore sst2, ma non nelle retine che
sovra-esprimono i recettori sst2. L’ipossia modifica anche l’espressione delle isoforme
dell’AC ma in differenti misure a seconda dell’espressione dei recettori sst2. Tra le nove
isoforme dell’AC, l’espressione dell’mRNA dell’isoforma AC VII aumenta
significativamente nelle retine WT e nelle retine sst2 KO ma non nelle retine sst1 KO. Questi
dati suggeriscono un coinvolgimento del sistema AC/cAMP nella mediazione sia della
neoangiogenesi retinica dovuta ad ipossia che dell’azione protettiva della SRIF. Inoltre,
l’isoforma AC VII sembra essere coinvolta in questi importanti effetti.
In conclusione questi studi contribuiscono ad ampliare le conoscenze sugli effetti
esercitati dalla SRIF in malattie della retina e supportano l’uso farmacologico della SRIF o di
suoi analoghi nel trattamento di patologie retiniche.

Ischemia is a primary cause of neuronal death in retinal diseases. The repertoire of
expressed transmitter receptors would determine the neuron’s responses to ischemic damage,
and peptidergic receptors may be involved. With a new in vitro model of the ischemic mouse
retina, we investigated whether an altered expression of somatostatin receptors could
modulate retinal responses to ischemia. We used retinas of somatostatin receptor 1 (sst1)
knock out (KO) mice, where sst2 are over-expressed and over-functional, and of sst2 KO
mice. TUNEL analysis of ischemic retinas showed a marked reduction of cell death in sst1
KO retinas, while there were no differences between wild-type (WT) and sst2 KO retinas. In
addition, caspase-3 mRNA expression was also reduced in sst1 KO as compared to WT
retinas. An immunohistochemical analysis demonstrated that different cell populations
responded differently to the ischemic insult, and that the persistence of some
immunohistochemical markers was greater in sst1 KO than in WT or in sst2 KO retinas. In
particular, rod bipolar cell survival was markedly improved in sst1 KO retinas, while it was
dramatically decreased in sst2 KO retinas. Furthermore, consistent with a role of glutamate
excitotoxicity in ischemia-induced neuronal death, retinal glutamate release was observed to
increase under ischemic conditions, but this increase was significantly reduced in sst1 KO
retinas. These observations demonstrate that an increased presence of functional sst2 protects
against retinal ischemia, thus implementing the background for the use of sst2 analogs in
therapies of retinal diseases such as glaucoma or diabetic retinopathy. On the basis of this
evidence, we tested the hypothesis that stimulation of over-expressed sst2 with exogenous
ligands may guarantee greater protection against ischemia. Isolated retinas from both WT and
sst1 KO mice were incubated in vitro for 1h in an ischemic solution and were treated with 10-
5 M SRIF, octreotide (a sst2 agonist) or SOM230 (a SRIF analog). As expected, in the absence
of pharmacological treatments, cell death was reduced in sst1 KO ischemic vs WT ischemic
retinas. In addition, SRIF, octreotide or SOM230 reduced cell death in ischemic WT retinas.
Surprisingly, instead of inducing larger rescue of retinal neurons, these treatments in ischemic
sst1 KO retinas resulted in significant increase of cell death throughout the retina. Our data
indicate that, although sst2 activation is beneficial against retinal ischemia, a limit exists to
this action, and the effects may turn detrimental. This limit may be due to receptor
desensitization or changes in the transduction pathways. Sst2, as the other SRIF receptors, are
G protein coupled receptors, therefore we investigated the molecules that regulate the activity
of G proteins in WT and in sst1 KO ischemic retinas. In particular, we investigated the
mRNA expression of G protein-coupled receptor kinases (GRKs) and that of regulators of G
protein signaling (RGSs). WT mouse retinas express GRK1 and GRK2, RGS1, RGS2, RGS5
and RGS9 subtypes. GRK1 and RGS1 mRNAs show a significant increase of their expression
after ischemic insult, therefore we investigated the expression of subtypes in ischemic retinas
following octreotide administration. WT ischemic retinas treated with octreotide showed a
significant reduction of both GRK1 and RGS1 mRNA expression. In octreotide-treated,
ischemic sst1 KO retinas, a similar reduction of GRK1 mRNA was observed, however, RGS1
mRNA expression remained unchanged with respect to untreated sst1 KO ischemic retinas.
The persistence of high expression levels of regulatory factors in octreotide-treated sst1 KO
retinas may inhibit sst2 responses and be responsible, at least in part, of the detrimental
effects of octreotide observed in sst1 KO ischemic retinas.
Hypoxia is the primary cause of retinal ischemia and it also causes a neoangiogenetic
response which is responsible of serious retinal illness. Recent data indicate that retinal
neoangiogenesis is contrasted by SRIF through its sst2 receptor. Using an in vivo mouse
model of hypoxia-induced retinopathy, we investigated the possibility that inhibition of
adenylyl cyclase (AC) is involved in SRIF anti-angiogenic actions. Hypoxia increased AC
responsiveness in wild type (WT) retinas and in retinas lacking sst2, but not in sst2-overexpressing
retinas. Hypoxia also altered AC isoform expression, but with different patterns
depending on sst2 expression level. Among the nine AC isoforms, AC VII isoform mRNA
and protein resulted the most affected. Indeed, in hypoxia AC VII expression was
significantly enhanced in WT retinas and it was further increased in sst2-lacking retinas, but
not in sst1 KO retinas. These data suggest an involvement of AC/cAMP in mediating both
hypoxia-evoked retinal neoangiogenesis and SRIF protective actions. In addition, the AC VII
isoform is a candidate to a main role in these mechanisms.
In conclusion, these studies contribute to the knowledge of the effects exerted by SRIF
in retinal disease and support the pharmacological use of SRIF, or SRIF analogues, in the
treatment of retinal pathologies.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/1967
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