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Title: Studio della simbiosi tra Aedes albopictus (Skuse) e Wolbachia pipientis in rapporto allo sviluppo di tecniche di lotta basate sulla incompatibilità citoplasmatica
Authors: Calvitti, Maurizio
Keywords: Aedes albopictus;Wolbachia pipientis;Incompatibilità citoplasmatica;BIO/07
Issue Date: 7-Mar-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 20. ciclo
Abstract: 
Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae)
(zanzara tigre) è un culicide antropofilo potenzialmente tra i più dannosi per la
salute dell’uomo in quanto vettore di diverse malattie virali (arbovirosi). La specie,
in continua espansione geografica sia in Europa che in Africa e nelle Americhe, è
recentemente salita alla ribalta dell’opinione pubblica per alcuni casi (circa 200),
accertati in Emilia Romagna, di Chikungunya, una forma di influenza osteoarticolare
di cui l’insetto è vettore.
Le tecniche di lotta chimica tradizionali, utilizzate per il controllo di molte
specie di zanzare, oltre ai problemi ambientali causati, non hanno riscosso grande
successo per alcune di queste, come nel caso di Ae. albopictus, a causa
dell’abbondanza e la diversità dei siti riproduttivi presenti anche in aree private
non accessibili. Ciò ha portato ad un rinnovato interesse per le strategie di lotta
genetica, quali ad esempio la Tecnica dell’Insetto Sterile (SIT). Questa tecnica di
lotta autocida si basa su lanci ripetuti nel tempo di maschi sterili allevati. La specie
Ae. albopictus è una buona candidata per tale strategia di lotta sulla base delle
seguenti caratteristiche biologiche ed ecologiche: - adattabilità ai sistemi di
allevamento massale, - monogamia, - bassa capacità di dispersione attiva e limitata
a poche centinaia di metri, - distribuzione delle popolazioni prevalentemente
urbana con affinità genetica tra le stesse. Tra le tecniche utilizzate per le
sterilizzazione, oltre all’irraggiamento, viene presa in esame l’Incompatibilità
Citoplasmatica (IC), una barriera riproduttiva post-copula tra individui della stessa
specie infettati da diversi ceppi del batterio simbionte Wolbachia. E’ stato
dimostrato che la IC può essere utilizzata nelle strategie di lotta autocida, in
particolare verso quelle specie “target” che presentano appropriati “patterns”
infettivi (coesistenza di popolazioni infette e non infette, presenza di popolazioni
infettate con ceppi differenti del batterio). Recentemente le potenzialità di
applicazione della IC sono state estese anche a quelle specie che in natura non
sono infettate da Wolbachia quali ad esempio Aedes aegypti e Ceratitis capitata.
Ciò è stato reso possibile grazie alla realizzazione di linee infettate artificialmente i
cui maschi risultano riproduttivamente isolati dalle femmine selvatiche.
Recenti studi hanno rilevato in Ae. albopictus la presenza di una doppia
infezione omogeneamente distribuita. Obiettivo di questo lavoro, articolato in due
fasi principali, è stato valutare la possibilità di utilizzare la IC quale sorgente di
sterilità nella lotta autocida contro Ae. albopictus: la prima fase è stata rivolta ad
acquisire una maggiore conoscenza delle caratteristiche della simbiosi Wolbachia-
Ae. albopictus (pattern di distribuzione dell’infezione, parametri dell’infezione,
effetti sui parametri di fitness dell’ospite); la seconda ha riguardato lo sviluppo di
metodiche per il trasferimento di ceppi di Wolbachia prelevati da altre specie di
insetti (Drosophila melanogaster e Culex pipiens) al fine di realizzare linee di
laboratorio incompatibili con le popolazioni naturali.
I risultati delle analisi molecolari del profilo di distribuzione dell’infezione
di Wolbachia, eseguite su di campioni di popolazioni, provenienti sia dal “range”
nativo che da alcune aree Europee di recente colonizzazione, hanno confermato
che il pattern di infezione (co-infezione wAlb A e wAlb B) è omogeneo in tutto
l’areale di Ae. albopictus. Per quanto riguarda lo studio della simbiosi tra Ae.
albopictus e Wolbachia, i dati osservati hanno rilevato che la simbiosi influenza
positivamente i parametri di “fitness” delle femmine, in particolare la longevità,
mentre l’effetto dell’infezione sulla fecondità e sulla fertilità è risultato
decisamente inferiore rispetto a quanto riportato in letteratura. Diversamente da
quanto osservato nelle femmine, l’effetto della simbiosi su parametri di fitness dei
maschi, è risultato ininfluente sia per quanto riguarda la capacità di sopravvivenza
che la competitività sessuale, valutata in termini di competività
nell’accoppiamento e della capacità spermatica. Lo studio, poi, delle altre
caratteristiche dell’infezione quali la trasmissione verticale e la IC, ha confermato
che in Ae. albopictus il batterio viene ereditato per via materna con la massima
efficienza (100 % di progenie infetta) e che la induzione di IC è sempre del 100%
indipendentemente dall’età del maschio.
I risultati ottenuti, avendo confermato l’omogeneità dell’infezione, hanno
reso la transinfezione un processo importante per sfruttare la sterilità dei maschi
indotta dall’IC. Si è così cercato sia di mettere a punto una metodica di
microiniezione embrionale che di selezionare ceppi del batterio più idonei per la
transinfezione (wMel prelevato da Drosophila melanogaster e wPip prelevato da
Culex pipiens). Dalla valutazione dei parametri delle transinfezioni (fitness adulti
transinfettati, induzione IC) è emerso che Ae. albopictus può essere infettato sia
con il ceppo di Wolbachia wMel, che con wPip. Poiché le femmine transinfettate
hanno evidenziato una bassissima capacità di sopravvivenza, il tentativo di
realizzare una nuova linea di Ae. albopictus transinfetatta non ha prodotto i
risultati attesi. Tuttavia l’aver osservato che i maschi transinfettati con wPip
inducono livelli di IC di poco inferiori al 100% è una buona base di partenza per
realizzare linee transinfettate di Ae. albopictus che possano esprimere livelli di IC
superiori a quelli sino ad oggi ottenuti con altre transinfezioni.

Aedes albopictus (Skuse) (Asian Tiger Mosquito) is an invasive
desease vector, spreading in Europe with some countries heavily colonized
(Albania and Italy) and others in the process of colonization (e.g. Croatia, France,
Greece, Montenegro, Spain, Switzerland). The spread of Aedes albopictus (Skuse)
is continuing also in Africa and America continents.
Recently an epidemic of Chikungunya virus, supported by Ae. albopictus,
took place in Northern Italy with more than 200 human cases.
The control of this species with conventional methods appears particularly
difficult mainly due to the large amount of breeding sites available in private areas.
The experience conducted until now on community participation showed
unsatisfactory results and consequently Ae. albopictus gained the role of main
mosquito pest in most of the urban areas of the peninsula.
Because of its recent introduction, the urban-related distribution, the low
active dispersal potential, this species has been considered a suitable target for
Sterile Insect Technique application, a suppression strategy that employs releases
of sterile males.
Previous studies have demonstrated that cytoplasmic incompatibility (CI), a
form of sterility induced by the intracellular bacterium Wolbachia, can be used,
instead of insect radiosterilization, as a mean for suppression strategies against
target species with appropriate patterns of infection (coexistence of infected and
uninfected populations, presence of populations harbourig different strains of
Wolbachia). Application of this approach to a wider range of target species has
been restricted by the lack of favourable patterns of infection as occurs in Ae.
Albopictus reported to be uniformly infected with two Wolbachia strains.
More recently, significant advances in microinjection methodology made it
possible to transfer Wolbachia infection over genus barrier into not naturally
infected hosts. Transinfection experiments based on the use of infected cytoplasm
from early embryos resulted in the establishment of isofemale lines carrying a new
Wolbachia infection in Aedes aegypti and Ceratitis capitata expressing complete
CI. In this way, the potential role of Wolbachia induced CI in pest control resulted
increased.
In this work we studied the symbiosis between Ae. albopictus and
Wolbachia in order to ascertain the role of Wolbachia-induced CI as a potential
tool for Ae. albopictus genetic control.
In the first part of the work, we investigated the pattern of distribution of
Wolbachia in Ae. albopictus and the effects of infection on adult fitness.
Furthermore we characterized some key parameters of the symbiosis such fidelity
of maternal transmission and CI level. In the second part of the work, our main
purpose was to generate a new incompatible infection in Ae. albopictus for genetic
control.
From the analysis of the pattern of distribution of Wolbachia, we found that
Ae. albopictus is uniformly superinfected with two Wolbachia types (wAlb A and
wAlb B). This means that it is not possible to identify natural incompatible strains
in this mosquito species and that artificially generated incompatible infection is
required.
Results from the study of the effects caused by the infection on adult fitness
allowed to associate an increase in survival capacity of females with the presence
of Wolbachia. Differently from data reported in literature, we found that the effect
of symbiosis on fertility and fecundity was not statistically significant.
By comparing infected and uninfected males we ascertained that Wolbachia
infection did not affect male longevity, mating competitiveness and sperm
capacity.
Results from the study of maternal transmission of infection and CI
confirmed previous data reported in literature. Maternal transmission efficiency
and CI were found at 100%. We confirmed that the multiple Wolbachia infections
which naturally occur in Ae. albopictus make this mosquito a useful system in
which to study the potential application of CI in insect pest control.
In the second part of the work, we developed a methodology to accomplish
the transfer of Wolbachia, via embryonic microinjection. We have evaluated the
supportive host background, the adaptation and the induction of CI, when
transferring in Ae. albopictus new Wolbachia strains from other infected species
(wMel from Drosophila melanogaster and wPip from Culex pipiens). We found
that Ae. albopictus can be artificially infected with both wMel and wPip strains. In
particular, transfected wPip males resulted incompatible when crossed with
uninfected females (egg mortality nearly 100%). Because transfected females were
not able to survive enough for reproduction, it was not possible to establish
transfected lines. Although these results are preliminar, they provide relevant
information on the possibility to obtain transfected lines of Ae. albopictus showing
a higher CI level than observed in transfected lines produced until now.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche
URI: http://hdl.handle.net/2067/1966
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