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Title: L’impatto dello stress idrico e delle alte temperature sull’emissione di isoprene, sulla fotosintesi e respirazione
Other Titles: Response of isoprene emission, photosynthesis and respiration to drought stress and rising temperatures
Authors: Brilli, Federico
Keywords: Marcamento 13CO2;Isoprene;Fotosintesi;Respirazione;Scambi gassosi;PTR-MS;AGR/05
Issue Date: 23-Apr-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 20. ciclo
Abstract: 
L’isoprene (2-metil 1,3-butadiene) è il composto organico volatile (VOC) emesso in percentuale più alta (44% del totale dei VOCs) dalle piante nell’atmosfera (Gunther et al. 1995; Kesselmeier & Staudt, 1999). Anche se il totale delle emissioni dei VOCs rappresenta solo il 2-3% del carbonio totale scambiato tra la biosfera e l’atmosfera (circa 69 Pg; Lal, 1999), la loro presenza può influenzare le proprietà chimiche e fisiche dell’atmosfera (Zimmerman et al. 1978) e contribuire alla formazione di ozono troposferico (Chameides et al. 1988). L’isoprene è sintetizzato maggiormente nei cloroplasti (Lichtenthaler 1999) a partire da substrati derivanti dalla fotosintesi, in una reazione catalizzata dell’enzima isoprene sintasi (ISPS) (Silver & Fall, 1995; Schnitzler et al. 1996). E’ ipotizzabile che i cambiamenti climatici determineranno condizioni ambientali sfavorevoli alla crescita ed allo sviluppo delle piante. Il sopraggiungere di condizioni di stress rappresentate principalmente dall’incremento medio delle temperature, da un aumento della lunghezza ed intensità dei periodi di siccità, oltre che dalla presenza di una più elevata concentrazione di ozono troposferico, potrebbero avere effetti contrastanti sul ciclo biogeochimico del carbonio, influenzando in maniera diversa sia la biosintesi di isoprene, che la fotosintesi e la respirazione.
Per investigare la risposta dell’emissione di isoprene (come indicatore del metabolismo secondario del carbonio), e dei processi di fotosintesi e respirazione (come indicatori del metabolismo primario del carbonio) in seguito al verificarsi di uno stress idrico in presenza di alte temperature o di elevate concentrazioni di ozono, piante di Populus nigra L. di un anno di età sono state fatte crescere a due diverse temperature (25 °C e 35 °C) e poi sottoposte ad un progressivo stress idrico. Per questa valutazione, sono stati utilizzati i parametri di FASW (Fraction of Available Soil Water) e FTSW (Fraction of Transpirable Soil Water). Inoltre, per studiare più approfonditamente la regolazione biochimica dell’emissione di isoprene in condizioni di progressiva limitazione dell’assimilazione del carbonio al procedere dello stress idrico, è stata misurata in vivo con la moderna metodologia di analisi chimica (PTR-MS) (Lindinger et al. 1998) unita a tecniche di marcamento isotopico delle molecole volatili, la variazione del contributo delle fonti di carbonio di origine cloroplastica o extra-cloroplastica alla formazione di isoprene.
Prima dell’inizio del periodo di stress idrico, nelle piante cresciute a 35 °C l’emissione di isoprene è risultata due volte maggiore all’emissione delle piante cresciute a 25 °C, contrariamente alla fotosintesi che è diminuita di ~ 30%, mentre la respirazione ha subito solo una piccola variazione di ~ 15%. I dati raccolti hanno evidenziato la sensibilità sia dell’emissione di isoprene
che della fotosintesi ad un aumento delle temperature di crescita di 10 °C, rispetto alla respirazione che invece ha subito un acclimatamento in corrispondenza della diversa temperatura di crescita (Ow et al. 2008). Poiché durante il procedere dello stress idrico sia a 25 °C che a 35 °C l’emissione di isoprene comincia a diminuire con un andamento più lento rispetto a quello della fotosintesi, la percentuale di carbonio utilizzata per produrre isoprene tende ad aumentare in maniera esponenziale una volta che viene superata una certa soglia di acqua disponibile nel suolo, anticipatamente in corrispondenza di alte temperature. In particolare, sia a 25 °C che a 35 °C, l’emissione di isoprene tende a rimanere costante durante le prime fasi di stress idrico, dopodiché subisce una leggera e temporanea stimolazione che precede una progressiva diminuzione verso valori minimi. All’intensificarsi dello stress idrico, gli esperimenti hanno confermato (Pegoraro et al. 2004a,b) come l’inibizione dell’emissione di isoprene avvenga solo in corrispondenza di una bassissima soglia di acqua disponibile nel terreno, quando la fotosintesi è ormai totalmente assente e gli stomi non hanno più la capacità di regolare il bilancio idrico della pianta. Dai dati raccolti durante l’analisi on-line del 13C incorporato nella molecola di isoprene, risulta che il carbonio proveniente dalla fotosintesi prima dell’inizio dello stress idrico nelle piante cresciute a 25 °C (78 – 90% del carbonio totale incorporato nella molecola di isoprene), scende al 16 – 42% in condizioni di scarsa disponibilità di acqua nel suolo (Brilli et al. 2007). Inoltre, la quantità di isoprene emesso in condizioni estreme di stress idrico (in assenza di fotosintesi) risulta indipendente dalla temperatura.
Dopo aver irrigato le piante sottoposte a stress idrico, sia a 25 °C che a 35 °C l’emissione di isoprene ha cominciato a recuperare velocemente come la fotosintesi. Comunque, mentre la fotosintesi dopo 15 giorni di regolari irrigazioni ha raggiunto gli stessi livelli registrati prima dell’applicazione dello stress idrico rispettivamente a 25 °C ed a 35 °C, la quantità di isoprene emesso è risultata simile ed indipendente dalla temperatura. Così, se da un lato i risultati ottenuti hanno confermato che l’emissione di isoprene è un processo resistente a moderate condizioni di stress idrico (Loreto & Sharkey, 1993; Fang et al. 1996, Brilli et al. 2007), dall’altro hanno mostrato per la prima volta un’interessante inibizione della stimolazione termica dell’emissione di isoprene dopo uno stress idrico. Dal punto di vista ecologico, la diretta conseguenza di questa osservazione è che episodi di stress idrico da cui le piante recuperano in maniera pressochè completa possono tuttavia ridurre l’emissione di isoprene emesso ad alte temperature (Fortunati et al. 2008).
In un’altra sperimentazione, piante di un anno di Populus nigra L. cresciute a 25 °C sono state sottoposte ad una fumigazione con elevate concentrazioni di ozono (150 ± 10 ppb) abbinata ad uno stress idrico, con l’intento di investigare la risposta dell’emissione di isoprene in presenza di un forte stress ossidativo indotto dall’ozono su foglie già esposte a stress idrico nelle quali la sintesi e l’emissione di isoprene è risultata resistente. Il trattamento con ozono ha mostrato un forte effetto di
depressione nei riguardi dell’emissione di isoprene, esacerbato dalla combinazione con lo stress idrico. Anche se questi risultati contrastano con quelli raccolti precedentemente relativi ad esposizioni acute ad ozono (Loreto & Velikova, 2001; Fares et al. 2007), è stato già evidenziato come il processo di sintesi dell’isoprene è sensibile all’inquinante e che l’emissione può essere largamente ridotta in corrispondenza di un forte danno alla fotosintesi (Calfapietra et al. 2007). Può essere anche ipotizzato che l’ozono, una volta penetrato all’interno del mesofillo fogliare, possa aver reagito con l’isoprene presente negli spazi intercellulari del tessuto lacunoso, provocando una rapida diminuzione della quantità di isoprene misurata all’esterno come emissione (Loreto et al. 2007). Inoltre, la fumigazione con ozono ha diminuito l’emissione di metanolo ed aumentato quella di isoprene in giovani foglie non ancora completamente espanse, suggerendo sia un’induzione anticipata dei fenomeni di senescenza con conseguente diminuzione dei tempi di accrescimento delle foglie, che un indiretto effetto sulle cratteristiche fisiologiche alla base del metabolismo primario e secondario (Fares et al, 2007).
Infine, è stata verificata la capacità dell’emissione di isoprene di indurre una maggiore resistenza al processo di fotosintesi in relazione al sopraggiungere di uno stress ossidativo attraverso l’applicazione di un trattamento con elevate temperature per un breve periodo di tempo (38 °C for 4 h) in foglie di piante di Platanus orientalis L. di uno e due anni di età cresciute sia in presenza di elevate concentrazioni di CO2, che a CO2 atmosferica. In corrispondenza di entrambe le condizioni di crescita, la fotosintesi è diminuita maggiormente nelle foglie nelle quali l’emissione di isoprene era stata precedentemente inibita dal trattamento con fosmidomicina, rispetto a quelle lasciate libere di emettere.
In conclusione, i risultati raccolti nel corso delle diverse sperimentazioni condotte hanno confermato l’importanza dell’isoprene nella protezione delle piante contro il sopraggiungere di stress ossidativi. Infatti, per le sue caratteristiche antiossidanti, l’isoprene può attivamemente contribuire alla rimozione di composti ROS (Reactive Oxygen Species) (Loreto & Velikova, 2001), ed aumentare la temotolleranza delle foglie (Sharkey & Singsaas, 1995) prevenendo la denaturazione del doppio strato lipidico delle membrane cellulari, impedendone così la conseguente perdita di funzionalità (Loreto & Velikova, 2001b; Sharkey & Yeh, 2001).

Isoprene is the most abundant volatile organic compounds (VOC) released by plants in the atmosphere (44% of the total amount of VOCs) (Gunther et al. 1995; Kesselmeier & Staudt, 1999). Isoprene influences the oxidative capacity of the troposphere (Zimmerman et al. 1978) and is a substrate for ozone production in polluted air (Chameides et al. 1988). Isoprene is mainly synthesized in the chloroplasts (Lichtenthaler 1999) from photosynthetic intermediates in a reaction catalyzed by isoprene synthase (ISPS) (Silver & Fall, 1995; Schnitzler et al. 1996). Incoming Global Change events leading to environmental stress conditions such as drought coupled with rising temperatures (and with high ozone concentration), may:
- strongly influence isoprene biosynthesis with various consequences on its emission;
- have contrasting effects on biogeochemical carbon cycles regarding photosynthetic carbon assimilated (and respired) by forests.
To investigate the impact of the interaction between rising temperatures and water stress on isoprene emission (IE), photosynthesis (A) and respiration (R), one-year-old Populus nigra L. saplings were first grown under two different temperatures (25 C° and 35 C°), and then exposed to progressive limiting soil water content. During progressive drought stress conditions, (IE), (A) and (R) were monitored and referred both to soil water availability (FASW) and to the amount of transpirable soil water (FTSW). Moreover, to investigate the biochemical regulation of (IE), proton-transfer-reaction mass spectrometer (PTR-MS) (Lindinger et al. 1998) was used to record the appearance of individually 13C-labeled atoms in the unfragmented isoprene molecule following exposure to air containing 13CO2.
Experimental results showed that in well-watered non-stressed plants higher growing temperature (35 C°) doubled IE and decreased A by ~ 30%, while R showed a not significant increase of ~ 15%. These results pointed out that both IE and A did not acclimate to a 10 °C higher growing temperature whereas R seemed likely to acclimate (Ow et al. 2008). Drought did increase the (IE) to (A) ratio, because (IE) was inhibited with a slower kinetics than (A), both at 25 °C and at 35 °C. FTSW calculation addressed that the percentage of carbon lost as (IE) dramatically increased earlier at 35 °C than at 25 °C. In unstressed leaves (IE) was temporary stimulated when (A) dropped at progressively stronger levels of drought at both temperatures, before starting to decrease to minimum levels. In plants grown at 25 °C, even when carbon fixation by photosynthesis was compensated by respiratory processes under limiting soil water availability, isoprene was emitted at a 30% rate of the emission observed in irrigated controls. Differently from pre-stress conditions, at
a severe drought stage only 16 – 42% of the (IE) was labeled by 13CO2 suggesting that extrachloroplastic carbon sources may increasingly supply carbon to isoprene when (A) became to be limited (Brilli et al. 2007). In severely drought-stress leaves, photosynthesis independent-(IE) was also independent of temperature, being the rate of emission similar at 25 °C and 35 °C. After re-watering, (IE) recovered as quickly as (A), but even if plants completely have recovered (A) recorded before drought stress, (IE) did not reach the pre-stress levels, particularly in leaves grown at 35 °C. Even though my experimental results supported previous evidences that isoprene emission is resistant to moderate drought stress conditions (Loreto & Sharkey, 1993; Fang et al. 1996, Brilli et al. 2007), for the first time it has highlighted that drought events are able to suppress temperature sensitivity of the process of isoprene biosynthesis, with important ecological consequences in reducing the emission of high emitters (Fortunati et al. 2008).
Furthermore, to assess the antioxidant properties of isoprene emission, one-year-old Populus nigra L. saplings grown at 25 °C were fumigated with high ozone concentration (150 ± 10 ppb) under progressive drought stress conditions. Ozone treatment showed a strong effect decreasing (IE), exacerbated by drought stress occurrence. Even if not in agreement with previous results (Loreto & Velikova, 2001; Fares et al. 2007), reduced (IE) can be mainly explained by serious (A) impairment (Calfapietra et al. 2007), or by direct isoprene reaction with ozone uptaken by leaves (Loreto & Fares, 2007). In addition, ozone exposure increased (IE) and decreased methanol emission in developing young leaves indicating a possible early senescence stage induction (Fares et al, 2007).
Enhanced thermotolerance by isoprene was studied in leaves of 1- or 2- years-old Platanus orientalis L. plants grown under normal and high CO2 levels. In both cases, after a high temperature treatment (38 °C for 4 h), photosynthesis activity was preserved in isoprene emitting leaves compared to leaves in which isoprene was previously inhibited by fosmidomicyn.
In conclusion, my results confirmed isoprene as an important compound in non-enzymatic defence of plants against oxidative stresses (Sharkey, 2005), possibly contributing to scavenge reactive oxygen species (ROS) (Loreto & Velikova, 2001) and to membranes stabilization capacity, leading to increase stress tolerance (Sharkey & Singsaas, 1995). In addition, the same results indicated that drought stress may have important and unforeseen consequences in regulating isoprene-mediated plant interaction with the global changing environment.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia forestale
URI: http://hdl.handle.net/2067/1937
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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