Messa a punto di tecniche molecolari per l'identificazione precoce di virosi e risanamento di materiale propagato di nuovo ottenimento in Lilium

Abstract

Negli ultimi 20 anni, in Italia, il Lilium è diventata la più importante delle colture floreali e questo ha fatto scaturire la necessità di produrre materiale vegetale con alti livelli di qualità, cioè bulbi sani con particolare riferimento all’assenza da virosi. Negli ultimi anni si è diffusa, nella diagnostica virale il metodo molecolare della RT-PCR che prevede la retro trascrizione di RNA in cDNA e un successivo ciclo di PCR. Tale tecnica è risultata essere efficiente, veloce e più sensibile della tecnica immunoenzimatica (ELISA TEST). Quindi con lo scopo di ottenere un protocollo efficace e veloce per diagnosticare la presenza di agenti virali nei cloni di ibridi Asiatici di Lilium, è stato messo a punto un metodo molecolare utilizzando RT-PCR. Il virus più comune e, l’unico specifico, che colpisce quasi tutti gli ibridi coltivati è l’ LSV (Lily Simptomless Virus) (Marani e Bertaccini, 1984) che in alcuni ibridi non provoca nessuna sintomatologia virale, mentre in altri può causare la deformazione delle foglie, che tendono ad arricciarsi e arrotolarsi a spirale e, la comparsa di striature sulle lamine. La sua presenza limita lo sviluppo vegetativo della pianta, diminuisce il numero e la grandezza dei fiori, rendendo la pianta più suscettibile ad attacchi patogeni come Botritys e Fusarium. Quando l’ LSV infetta le piante insieme al CMV (Cucumber Mosaic Virus), caso molto frequente, la sintomatologia si complica: le foglie manifestano mosaico in striature, anulature di colore brunastro e tacche necrotiche; anche i fiori vengono danneggiati, il loro sviluppo è ostacolato o compaiono rotture di colore e screziature dei petali. Bulbi di ibridi Asiatici di Lilium (‘409’, ‘599’, ‘20’, ‘00158’, ‘0045’, ‘0097’, ‘0035’, ‘00136’, ‘216’, ‘505’), con buone caratteristiche commerciali ed agronomiche (riduzione o assenza di polline, nuove forme e colori dei fiori, taglia elevata, idoneità alla coltivazione in pieno sole) sono stati presi in campo e tramite propagazione ‘in vitro’ di scaglie sono stati ottenuti nuovi bulbetti sottoposti a una prima diagnosi molecolare tramite RT-PCR. L’ RT-PCR è stata condotta utilizzando il Kit della Sigma ‘Enhanced Avians HS RT-PCR’. Sono stati usati primers degenerati, sintetizzati a partire dalle proteine del capside di 4 LSV e 17 CMV, che amplificano 483 e 408 bp di specifici frammenti di LSV e CMV rispettivamente. I bulbetti risultati virosati, sono stati sottoposti a un primo prelievo di apice meristematico, nel tentativo di risanarli. E’ stata effettuata un’ulteriore diagnosi (RT-PCR) e successivamente, su bulbetti ancora virosati, è stata effettuata una termoterapia (42 giorni a 35 °C) e un secondo prelievo di apice meristematico, cercando di mettere a punto un protocollo anche per il risanamento. I cloni ‘599’ e ‘409’ sono stati sottoposti sia a diagnosi mediante ELISA test ( condotto presso l’Università di Bologna Sezione di Scienze e Tecnologie Agroambientali), che a diagnosi molecolare tramite RT-PCR per convalidare l’efficienza del metodo molecolare in cloni di ibridi Asiatici. Successivamente l’RT-PCR è stata applicata per verificare lo stato di sanità di piante ottenute mediante propagazione di meristema ‘in vitro’. Gli altri cloni sono stati analizzati solo mediante RT-PCR. Le piante virus-free sono state cresciute ‘in vitro’ e successivamente acclimatate in serre ombreggiate. Dopo un anno dalla messa a dimora in campo le piante virus-free sono cresciute vigorosamente e sviluppando un discreto apparato fogliare. Sui cloni risanati sono state effettuate periodicamente altre indagini a campione che hanno dato sempre risultati negativi, cioè assenza di virosi.

Lilies have become the most important floral crop in Italy in the last 20 years and this has created a need to produce high-quality, healthy bulbs free from virus. In recent year, a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique has been used for detection of specific virus strains in some plant species. This method showed the potential to have a greater sensitivity than ELISA. In order to obtain a fast and efficient protocol to detection of Lily symptomless virus (LSV) and Cucumber Mosaic Virus (CMV) in Asiatic hybrid lily lines, a simple and original method was established by RT-PCR. LSV is a mayor virus in Lilium (Marani e Bertaccini ,1984) that decrease plant growth vigour and the quality of the cut flower, yet infected plants show no distinct symptoms. When LSV combines with CMV (Cucumber Mosaic Virus) the symptoms are more heavy: the plants become more susceptible to pathogenous like Botritys e Fusarium. Stock bulbs ( with new agronomiques and commercials characteristics like pollenless, new shapes and colours of flower,) of Asiatic hybrid lily lines (‘409’, ‘599’, ‘20’, ‘00158’, ‘0045’, ‘0097’, ‘0035’, ‘00136’, ‘216’, ‘505’) were used as explants. From the scales were achieved new bulblets by ‘in vitro’ propagation. The new bulblets were analysed by RT-PCR. RT-PCR were performed using ‘Enhanced Avians HS RT-PCR’ Sigma Kit. Degenerates primers were used and these primers were designed according to amino acid sequences of the coat protein in 4 LSV and 17 CMV and used to amplify 483, 408 bp specific fragments from LSV, CMV respectively, by PCR. From bulblets virus infected were excised shoot meristems and micropropagated. RT-PCR was carried out and subsequently on the bulblets, also virus infected, were made thermotherapy (42 days at 35 °C) and a second meristem cut was made from heat treated material. The line ‘599’ and ‘409’ were analyzed either by ELISA ( achieved by University of Bologna, Division of Sciences and Agroenvironmental Tecnologies) or by RT-PCR to compare the efficiency of two different tests in Asiatic hybrid lily. Subsequently RT-PCR was applied to verify the sanitary status of ‘in vitro’ meristem derived plants. The other lines were analyzed only by RT-PCR. The virus-free lily bulblets grew vigorously ‘in vitro’ and acclimatized promptly. After the first year of culture, the plants virus-free were vigorous and produced many leaves. On virus-free lily were carried out, periodically, other surveys that have always given negative results, namely the absence of virus infection.